csd基因决定蜜蜂性别的分子机理研究

The csd is the key factor in sex determination of the honeybee. when a bee contains two different csd alleles, it will develop into female, while those containing one or two of the same csd allele will develop into males. By now, the molecular mechanism of csd gene in determining the sex development of honeybee is unclear. In this study, we will adopt yeast two-hybrid and GST pull-down approaches to detect whether proteins from two different csd alleles or from one csd allele itself can interact,and identify domains of Csd protein that are directly involved in the self-interaction in the case of interaction.Meanwhile, we will identify pre-mRNA splicing factors that interact with csd by screening a yeast two-hybrid cDNA library and study their function. Furthermore, we will identify damains of Csd protein that are directly involved in the protein-protein interactions between the Csd and the pre-mRNA splicing factors. This project aimed to clarify the specific molecular mechanism of the csd gene in determining the sex development of honeybee, which will provide a theoretical basis for the artificial control of honeybee sexes in the future.

csd基因为蜜蜂性别决定关键基因，当个体含有两个不同的csd等位基因时发育成雌性，含有一个或两个相同的csd等位基因时发育成雄性，目前对于csd基因在蜜蜂性别决定中发挥作用的具体分子机理还不清楚。本研究利用酵母双杂交、GST pull-down技术分析由两个不同的csd等位基因编码的蛋白是否互作，以及同一个csd等位基因编码的蛋白自身是否互作，在有互作的情况下进一步鉴定参与互作的结构域；通过筛选酵母双杂交cDNA文库鉴定出与Csd蛋白相互作用的前体mRNA拼接因子并进行进一步的功能研究，鉴定出参与Csd蛋白与其它拼接因子互作的结构域。通过本项目的研究旨在弄清csd基因决定蜜蜂性别的具体分子机理，为以后通过转基因进行蜜蜂性别的人工控制提供理论依据。

csd基因为蜜蜂性别决定关键基因，当个体含有两个不同的csd等位基因时发育成雌性，含有一个或两个相同的csd等位基因时发育成雄性，但是对于csd基因在蜜蜂性别决定中发挥作用的具体分子机理还不清楚。.本研究利用GST pull-down技术分析了由两个不同的csd等位基因编码的蛋白是否互作，以及同一个csd等位基因编码的蛋白自身是否互作，并进一步分析了参与互作的结构域。结果表明两个不同的csd等位基因间存在互作，且同一个等位基因自身也存在互作，截短实验表明只要Csd蛋白含有RS结构域和脯氨酸富集结构域中的任何一个，不同Csd蛋白之间或同一个Csd蛋白自身就能互作。.本研究通过筛选酵母双杂交cDNA文库获得了一个能够与Csd蛋白互作的因子pabp2。该基因含有8个外显子、7个内含子，编码的蛋白为228aa，具有一个RRM结构域。RNAi实验表明pabp2基因能够影响下游基因dsx在雌性和雄性胚胎中的选择性剪切。GST pull-down实验证明pabp2在体外能够与csd互作。RT-PCR结果表明pabp2基因在胚胎期的雌雄中均有表达，无性别特异性。截短实验表明只要Csd蛋白含有RS结构域和脯氨酸富集结构域中的任何一个，它就能与pabp2互作。这些结果说明pabp2基因是一个调控下游基因前体mRNA选择性剪切的辅助性剪切因子，它通过与csd基因互作调控下游基因在雌雄中的选择性剪切，从而影响蜜蜂雌雄性别发育。.本研究克隆了果蝇性别决定基因rbp1在蜜蜂中的同源基因Amrbp1。Amrbp1基因mRNA存在三种不同的选择性剪切形式Amrbp1-R1、Amrbp1-R2、Amrbp1-R3，mRNA长度分别为696nt、790nt、771nt，编码的蛋白分别为130aa、166aa、162aa。Amrbp1的三种剪切形式均含有一个RRM结构域和一个RS结构域。RT-PCR表明Amrbp1基因的三种选择性剪切形式在胚胎及幼虫的不同发育时期均有表达，且无雌特异性或雄特异性表达形式。GST pull-down实验表明Amrbp1与csd基因不存在相互作用。对于Amrbp1是否参与蜜蜂性别决定还需要进一步研究。.本项目的研究结果进一步弄清了csd基因对下游基因进行调控的具体分子机理，丰富和完善了蜜蜂性别决定调控途径，为以后通过转基因进行蜜蜂性别的人工控制提供了理论依据。