辣木蛋白酶及其凝乳机理研究

The Morlnga oleifera is a kind of edible perennial tropical trees, with a characteristic advantages and key development industry in Yunnan. Morlnga oleifera industry developed slowly as a result of scientific research lag and technical bottleneck. The protease and milk coagulating properties were found in Morlnga oleifera flower, leaves and seeds according to the former test, but the science questions need to be intensive researched. The project intends to conduct the milk-clotting mechanism of protease in Morlnga oleifera. Extraction, isolation and identification of the protease from Morlnga oleifera flower, leaves and seeds is going to be developed by the steps of bath, vacuum concentration, freeze-drying, separation, ultrafiltration and mass spectrum. Casein is the main protein in milk, and its structural changes lead to milk curd. The milk-clotting mechanism of the Morlnga oleifera protease will be researched according to the cleavage site on κ-casein and casein degradation and the flocculating reaction, microscopic structure change by SDS-PAGE，matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass and HPLC and Confocal Scanning Laser Microscopy, infra-red spectrum during coagulation. The scientific theory of milk-clotting mechanism from Morlnga oleifera protease is important to develop new chymosin and High value of Moringa products, that benefit to supplement the scientific system and promote industrial development of Morlnga oleifera.

辣木为可食用的多年生热带落叶乔木，是云南的特色优势和重点发展产业，但科学研究的滞后导致的技术瓶颈影响了产业的发展。根据前期实验和相关报道，辣木花、叶、籽均含有蛋白酶，且能凝乳，但未见其深入研究。本项目拟揭示辣木花、叶、籽的蛋白酶及其凝乳机理。采用等电点分离、超滤纯化、ESI质谱分析等新技术，分离鉴定辣木叶、花、籽蛋白酶，研究其酶学特性和结构。酪蛋白是乳蛋白质的主体成分，其变化导致凝乳，①根据电泳条带、HPLC多肽图谱等的变化分析辣木蛋白酶对α、к、β-酪蛋白的降解作用；②采用电泳、PVDF转膜、电离飞行质谱-N末端测序技术，研究凝乳过程中κ-酪蛋白的酶切位点等一级结构变化；③利用扫描电镜、红外光谱等手段探索凝乳过程中酪蛋白胶束的絮凝反应、微观结构等变化；揭示辣木蛋白酶的凝乳机理。项目为新型凝乳酶和辣木酵素等高附加值产品的研发提供理论支撑，有利于完善辣木研究科学体系和促进产业发展。

项目立足于具有云南特色优势、资源丰富、发展势头强劲，但科学研究相对滞后、技术瓶颈凸显的辣木为研究对象，通过研究辣木叶、花、籽蛋白酶及其对酪蛋白分子结构变化影响，揭示辣木凝乳功能成分及其凝乳机理等科学问题，为新型凝乳酶、辣木活性成分等高附加值辣木产品的研发提供理论支撑，进一步完善辣木研究科学体系和促进辣木产业发展。通过4年的研究，圆满完成了项目规定的任务，取得了较好的成效。.基于蛋白组学方法，在辣木叶中鉴定了3778个蛋白质，包括676个水解酶活性蛋白、548个氧化还原酶活性蛋白、524个转移酶活性蛋白。辣木籽中鉴定了921个蛋白质，包括149种水解酶、111种氧化还原酶、66种催化活性蛋白、45种肽酶和21种内肽酶。在辣木花中鉴定了4004个蛋白质，分子量集中在40到70kDa之间，61.5%具有催化活性的蛋白酶，43.7%蛋白参与大分子代谢。从辣木叶中分离鉴定了一种丝氨酸凝乳酶，分子量为56.146kDa, 等电点5.27。从辣木籽中分离鉴定了一种天冬氨酸凝乳酶，相对分子质量为45.517kDa。.辣木凝乳酶对酪蛋白（CN）以及α-CN、β-CN、κ-CN均有降解作用，辣木叶凝乳酶对κ-CN的酶切位点为Arg93-His94，辣木籽凝乳酶对κ-CN的酶切位点为Gln113-Asp114，均生成副κ-CN和酪蛋白巨肽，不溶于水，可形成凝乳。辣木籽蛋白酶与κ-CN反应的有效絮凝反应是在60min内，超过该时间段将发生二次降解反应。辣木蛋白酶使酪蛋白在0-60min内出现较多的絮凝现象，颗粒大小逐渐变大，而60-120min内絮凝沉淀物逐渐变少，120-180min内絮凝沉淀几乎维持不变。.项目发表论文7篇，其中SCI3篇，（International Journal of Biological Macromolecules2篇、LWT-Food Science and Technology1篇，累计 IF=12.407）、中文核心期刊4篇。申报国家发明专利2项（一种从辣木籽中提取具有水解活性蛋白酶的方法、一种能促进羊乳凝固的辣木籽蛋白酶及其制备的多肽和应用）。培养博士生1名、硕士生1名、本科生3名，1人获云南省优秀毕业生。项目主持人获云南省“万人计划”。