青海牧区产凝乳酶细菌及其凝乳酶的多样性研究

Milk-clotting enzymes is the key enzyme in the production of cheese,which occur in animal tissues, higher plants and microorganisms. Attention has been focused on the milk-clotting enzymes from microbial sources because of its extensive sources, lower cost, and easy extraction. The Tibetan plateau in china is the source of a diversity of microbial species. Many studies have been carried out about microbial species in this region, but there are few document about the bacteria producing milk-clotting enzyme in this region. In this program we intent to isolate microorganisms producing milk clotting enzymes form the samples collecting from qinghai pastoral area in the Tibetan plateau.On this condition,the strains were idetified and the population diversity were analyzed. The protein sequence of milk-clotting enzymes from different bacteria will be determinded and the structure of the enzymes will be analyzed, predicted and compared using softwares SOPMA and Swiss-Model Workspace. The hydrolysis of casein was analyzed by Urea SDS-PAGE, RP-HPLC, and MALDI-TOF/MS, and the most suitable substrates of the milk-clothing enzymes, the hydrolysis site, and enzymic property will be determinded and compared. On this condition, the structure-activity relationships of the milk-clothing enzymes from different sources will be explored. This project will establish the foundation for excavation of milk-clothing enzyme producing strains, and development of new type of milk-clothing enzyme from microbial sources.

凝乳酶是奶酪生产中的关键酶，主要来源于动物、植物和微生物。微生物凝乳酶以其来源广泛、成本低和提取方便等优点成为研究热点。青藏高原地区蕴藏着极为丰富、独特的微生物种质资源，近年来对于该地区微生物资源进行了大量研究，但对产凝乳酶细菌研究报道较少。本项目拟从地处青藏高原的青海牧区广泛采集样品，分离筛选产凝乳酶细菌，对菌株进行鉴定并分析其种群多样性；在凝乳酶的序列测定的基础上，利用SOPMA和Swiss-Model Workspace等软件对酶的结构进行预测；采用Urea SDS-PAGE、RP-HPLC和MALDI-TOF/MS等方法分析不同来源的凝乳酶对酪蛋白的降解产物，确定不同来源凝乳酶的最适作用底物、作用位点和酶学性质；在此基础上分析不同种类的细菌凝乳酶的结构与凝乳特性间的关系，为发掘优良产凝乳酶细菌菌株和开发新型微生物凝乳酶奠定基础。

凝乳酶是奶酪生产中的关键酶，主要来源于动物、植物和微生物。微生物凝乳酶以其来源广泛、成本低和提取方便等优点成为研究热点。青藏高原地区蕴藏着极为丰富、独特的微生物种质资源，近年来对于该地区微生物资源进行了大量研究，但对产凝乳酶细菌研究报道较少。本项目从地处青藏高原的青海牧区广泛采集样品，分离筛选产凝乳酶细菌，对菌株进行鉴定并分析其种群多样性；分析不同来源的凝乳酶对酪蛋白的降解产物，确定不同来源凝乳酶的最适作用底物、作用位点和酶学性质，为发掘优良产凝乳酶细菌菌株和开发新型微生物凝乳酶奠定基础。主要研究成果如下：.1、基于Illumina MiSeq高通量测序平台，对曲拉样品中细菌16S rRNA V3-V4区进行测序，通过Alpha多样性、物种分类组成及Beta多样性分析对曲拉中细菌多样性及群落结构进行分析。结果表明：曲拉中具有高度的细菌多样性，并且不同来源的样品存在差异；曲拉样品中优势门为厚壁菌门 (Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，优势属为乳杆菌属(Lactobacillus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳球菌属(Lactococcus)。.2、采用酪蛋白培养基，从青海牧区的曲拉等样品中分离筛选产凝乳酶细菌并分析其多样性。结果表明，样品中共分离得到21株产凝乳酶细菌，它们在麸皮汁培养基中的凝乳酶活力介于11.3~1215.6 SU/mL；菌株HN 1在麸皮培养基中发酵时，凝乳活力最高，可以达到1215.6 SU/mL，此时对应的蛋白水解活力为14.6U/mL；21株菌中有14株菌属于芽孢杆菌属（Bacillus），说明芽孢杆菌是产凝乳酶细菌中的优势属；另外，多样性指数的分析结果表明该地区的产凝乳酶细菌具有良好的多样性。.3、对6株菌HN1、GL2、GL3、GL4、HX2、HX4的酶学特性进行比较，发现它们的热稳定性、pH稳定性、最适温度、最适pH等特性均有一定的差异。对菌株HN1凝乳酶的作用底物分析表明，凝乳酶对aS1、b-和k-酪蛋白单体都有明显的水解作用，对aS1-酪蛋白的水解能力最强，其次是b-酪蛋白和k-酪蛋白。HN1凝乳酶酶凝乳是由于水解k-酪蛋白Thr121-Ile122，破坏了酪蛋白微粒的稳定性，从而引起酪蛋白微粒凝结形成凝胶。