贯筋藤凝乳机理的研究

在云南西部及西北部地区，长期以来在加工乳饼（有人称之为"中国式奶酪"）时，其凝乳剂不是选用通常使用的酸水，而是使用野生植物-贯筋藤茎杆水溶液作为凝乳剂，但至今未见贯筋藤凝乳剂的相关研究报道，其凝乳剂及其凝乳机制的研究是目前迫切需要解决的关键科学问题。本项目通过对贯筋藤凝乳过程中凝乳物质成分、乳蛋白质及其结合物质的理化变化、化学键变化、分子结构、性质及其流变学特性、凝胶特性等的研究，探索乳的酸凝、钙凝、酶凝以及其他凝乳物质引起凝乳的机理过程，弄清楚贯筋藤凝乳功能物质使乳蛋白质凝固的机制。研究成果对解决贯筋藤凝乳物质、凝乳机制等科学问题，探寻凝乳剂替代品、保障凝乳剂的安全性以及开发新型天然食品添加剂-贯筋藤凝乳剂等，具有很重要的科技、经济和社会意义。

项目旨在揭示贯筋藤凝乳功能成分及其凝乳机理。.1.贯筋藤凝乳剂及其凝乳功能成分初探.（1）经温水浸提、真空浓缩，贯筋藤凝乳剂为红棕色粘稠液体，有轻微焦糖味，易溶于水，pH 8.3~8.8，凝乳温度85℃。（2）酸、钙和酶是导致凝乳的三大成分。① 贯筋藤凝乳剂pH 8.32，其凝乳关键环节pH≥6.0，凝乳时间、感官状态与酸凝现象有显著差别，说明其并非酸凝。② 贯筋藤凝乳剂的钙含量不足以凝乳，其中的钙被完全螯合后仍能凝乳，排除钙凝因素。③比较贯筋藤凝乳剂、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶对羊奶的凝乳效果，凝乳状态相似，产品的感官、理化指标差异小，凝乳功能成分可能是蛋白酶。.2. 贯筋藤蛋白酶及其酶学特性.（1）贯筋藤凝乳剂经40%的硫酸铵盐析、透析、冷冻干燥成粉末。通过SDS-PAGE凝胶电泳，得到24KDa和10KDa蛋白酶。用millipore 3K超滤离心管冷冻离心分离出24KDa和10KDa蛋白，经凝乳验证，24KDa蛋白酶为主要凝乳物质，经SDS-PAGE凝胶电泳，胶内酶解 (Trypsin,20h）、抽提酶解肽段、ESI质谱、数据分析，凝乳蛋白酶为Procerain B。巯基是酶的凝乳功能基团。（2）贯筋藤蛋白酶的凝乳活力、蛋白分解活力分别为32.72 U/mg、1.76 U/mg，最适凝乳温度85℃、pH=9。.3. 贯筋藤蛋白酶凝乳机理.经Q-TOF2分析，酶切K-CN肽段为12KDa和6.9KDa。反应液经SDS-PAGE凝胶电泳、PVDF转膜后N末端测序，K-酪蛋白酶切位点为Pro90-Thr91。此外，通过分析凝乳块Ca2+和乳清中酪蛋白巨肽（CGMP）含量，酶切使副K-酪蛋白和CGMP增加。Ca2+易使副K-酪蛋白凝固；αs1-酪蛋白、β-酪蛋白失去外缘K-酪蛋白的胶体保护，形成凝乳。.4. 贯筋藤蛋白酶在奶酪加工中的应用研究.与小牛皱胃酶和微生物凝乳酶相比，贯筋藤蛋白酶对Mozzarella干酪的α-CN有明显的降解作用；呈现鲜、甜味的谷氨酸、组氨酸含量高；产生52种挥发性风味物质，其中挥发性酸和羰基化合物是干酪特征风味物质；干酪组织结构；该酶应用前景好。项目实施期间，申请发明专利3项，其中授权1项；发表论文8篇，其中SCI 1篇、中文核心7篇；国际会议论文2篇；培养硕士生4名。