长链非编码RNA H19招募eIF4A3调控结直肠癌发生发展的分子机制研究

Long non-coding RNAs play very important role in the development of cancer. The biological function and molecular mechanism of H19 in colorectal cancer is rarely reported. In preliminary experiment, we were excited to find the expression of H19 is upregulated in colorectal cancer tissues, which is closely related with tumor differentiation, distant metastasis, TNM stage and prognosis. We also found that H19 can promote the proliferation of colon cancer cells and there is potential interaction between H19 and eIF4A3. Therefore, we hypothesize that H19 could promote the development of colorectal cancer through the recruitment of eIF4A3, which may regulate the expression of some important oncogenes or anti-tumor genes. This study is designed to reveal the function and molecular mechanism of H19 in colorectal cancer using colorectal cancer tissue/plasma samples, cell line models in vitro, xenografts of nude mice in vivo. By the technology of RNA interference, lncRNA cloning, RNA immunoprecipitation, RNA Pulldown, in situ hybridization and the correlation analysis between H19 expression and clinical characteristic, this project is aimed at elucidating the noval mechanism of H19 in colorectal cancer and providing new therapeutic stragety for colorectal cancer.

长链非编码RNA(lncRNAs)在肿瘤发生发展中具有重要作用。lncRNA H19在结直肠癌中的生物学功能和分子机制鲜有报道。项目组前期研究发现H19在结直肠癌组织中显著升高，且与肿瘤分化、远端转移、分期和预后密切相关。体外实验发现H19可以促进结肠癌细胞的增殖，同时发现H19与真核翻译起始因子4A3(eIF4A3)相互作用。据此，我们提出如下假设：H19招募eIF4A3调控肿瘤关键基因的表达，从而促进结直肠癌的发生发展。本课题拟应用结直肠癌临床组织/血浆样本、结肠癌细胞体外模型和裸鼠移植瘤模型，通过RNAi干扰，基因克隆，RNA免疫共沉淀，RNA Pulldown、原位杂交等多种研究手段，并将H19表达水平和临床指标进行关联分析，从临床样本、分子、细胞以及动物整体水平深入探讨lncRNA H19在结直肠癌发生发展中的分子机制，为结直肠癌的临床治疗提供新的理论基础。

背景：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，我国CRC的发病率呈逐年上升的趋势，严重影响国人的健康和生活质量，进一步揭示CRC的分子生物学机制，对其防治及预后判断具有重要的临床指导意义。研究表明长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）参与多种肿瘤的发生，本课题探讨lncRNA H19在结直肠癌发生过程中的作用机制。.主要研究内容：收集手术切除、经病理确诊的CRC的病例标本及其相应的癌旁组织。应用实时定量PCR检测H19表达情况，与临床病理特征（肿瘤浸润深度、临床分型分期、病理分期、淋巴结转移等）及预后（生存时间）进行相关性分析。构建H19过表达质粒野生型（包含H19全长）、突变型（H19第一外显子处miR-675序列突变），合成针对H19的siRNA；利用CRC细胞系（HCT116、HT29），从中筛选出H19高表达最明显的HT29、HCT116作为研究对象，转染H19 siRNA；同时应用H19低表达的正常结肠上皮细胞系CCD-18CO，转染H19过表达质粒，从正、反两方面进行功能学研究。采用流式细胞术、MTT法测定生长曲线、克隆形成实验、H19对CRC细胞增殖的影响。采用qRT-PCR、Western blot检测表型相关的关键因子（细胞周期相关蛋白cyclin D/CDK/p16/p21/p27）表达情况。通过生物信息学软件对H19序列进行分析，预测到可能的互作蛋白eIF4A3，利用RNA免疫共沉淀(RIP)技术加以验证。.重要结果：结直肠癌组织中H19表达明显上调，且高表达情况与恶性临床指标及不良预后密切相关；H19过表达促进结肠癌细胞的增殖能力，表达下调抑制结肠上皮细胞的增殖能力；H19可加速细胞周期进程从而增强结肠癌细胞的增殖；H19能够与真核翻译起始因子4A3相互作用，参与结直肠癌的发生发展。.科学意义：研究表明H19在结肠癌组织中表达水平升高，过表达H19后明显促进结肠癌细胞的增殖，H19影响真核翻译起始因子4A3与细胞周期相关因子的翻译调控，H19有望临床防治结直肠癌的新靶点。.