Oddi括约肌功能障碍状态下一氧化氮对括约肌细胞钾通道的影响

Oddi括约肌功能障碍（SOD）属功能性动力紊乱，括约肌张力增高是其主要表现，但其机理尚不清楚，因而临床上对SOD的药物治疗靶点不明确。本课题组以平滑肌兴奋性及其张力调控的生理学理论为基础，结合前期研究成果，以一氧化氮（NO）供体硝酸酯类药物对Oddi括约肌（SO）运动功能影响的现象为线索，探讨NO和钾通道在SOD发病机理中的作用。本课题拟利用等长张力记录方法、四甲基偶氮唑盐微量比色分析法、原位末端标记法、流式细胞术和标准全细胞膜片钳技术等方法研究钾通道在NO诱导的SOD患者SO平滑肌舒张中的作用、NO对SOD患者SO平滑肌细胞凋亡的诱导和对钾通道的影响。以期对SOD患者括约肌张力增高的生理和病理学基础有更为深入的认识，为NO和钾通道调控SO张力的更深入研究奠定基础，同时为探索临床SOD治疗的有效靶点提供实验依据。

本项目组严格按照项目计划书要求按期完成了全部预定研究任务，达到了预期研究目标，并寻找到了多个新的能深入探索的、基础与临床相结合的支撑点。.项目组首先采用等长张力记录的方法观察外源性一氧化氮（NO）供体硝普钠（SNP）对不同钾离子通道阻滞剂预处理的Oddi括约肌（SO）肌环的舒张作用。结果发现，在Oddi括约肌功能障碍（SOD）模型上分别利用盐酸四乙铵（TEA）选择性阻断BKCa通道、4-氨基吡啶(4-AP)选择性阻断KV通道后，SO收缩活动明显增强，加入累积浓度SNP可抑制其收缩作用且呈浓度依赖关系，但其松弛率比对照组显著减小，提示NO可能部分通过BKCa通道、KV通道松弛SO。项目组又将SO细胞进行原代分离和培养，采用原位末端标记（TUNEL）法、四甲基偶氮唑盐微量比色分析（MTT）法及流式细胞术测定SNP对SO细胞凋亡的影响。结果发现，TUNEL染色 SNP处理后的SO细胞凋亡数目较对照组显著增加，MTT法测定不同浓度SNP处理的SO细胞生长抑制率显著高于对照组；流式细胞术测定加入SNP组的SO细胞凋亡率显著高于对照组，提示外源性NO供体SNP可诱导SO细胞凋亡，其可能是NO降低SO压力的机制之一。项目组又采用全细胞膜片钳技术，观察SNP对SO细胞BKCa和Kv电流及细胞兴奋性的影响。结果发现，SOD状态下SO细胞的BKCa和Kv通道的活性较正常状态下低，表明SOD状态下这两种钾通道活性下降，SO平滑肌细胞钾离子外流减少，细胞处于去极化状态，SO平滑肌细胞兴奋性增加，钾通道活性下降可能与SOD状态下SO高张状态有关；在SOD组SO细胞中加入SNP后，SO细胞的静息膜电位降低，细胞膜电位复极化或超极化；脉冲及斜坡刺激的BKCa pA/pF和Kv pA/pF显著提高，表明NO可开放SOD状态下SO细胞的BKCa和Kv通道，导致细胞内钾离子外流，恢复细胞膜电位，使细胞复极化，从而下调SO平滑肌细胞的兴奋性。上述研究结果的发现对SOD状态下SO括约肌张力增高的生理和病理学基础有了更为深入的认识，为NO和钾通道调控SO张力的更深入研究奠定了基础，同时为探索临床SOD治疗的有效靶点提供了实验依据。.本项目组自主创新的工作以系列文章发表在国内核心期刊上，已将部分研究成果正式发表学术论文4篇，多次在国内外学术会议及活动中交流。本项目累计培养了博士研究生1名，硕士研究生6名。