脑脊液微净化吸附去除脑实质Aβ可行性研究

Because drugs targeted to Aβ showed ineffective on treatment of Alzheimer's disease (AD), many peoples question whether Aβ is the inducing factor of AD. Detailed analysis found that there are many deficiencies in the method and procedure of the AD treatment targeted to Aβ. Thus, to solve the problems, a new method is needed to fast remove Aβ in brain parenchyma and the time of the treatment should be re-considered. Based on the new knowledge of glymphatic system and cerebrospinal fluid (CSF) which shows important functions on substance transportation from parenchyma to CSF, and the advantage and disadvantage of microdialysis technique which could obtain research samples in vivo, we provide a new method called micro-purification technique, which might remove Aβ from CSF directly and brain parenchymal indirectly. Simply, Aβ adsorbents are obtained after Aβ nanobodies are synthesized on matrix, micro-purification system is prepared by piping Aβ adsornent into piping system of microdialysis. At last, Aβ is removed through micro-purification system. Our research would provide not only a new method to remove pathogenic agents in CSF, including Aβ, but also the time to treatment AD.

以Aβ为靶标的阿尔茨海默病（AD）治疗效果不理想使大家对Aβ是否是AD发生发展的诱导因素提出了质疑，仔细分析发现以Aβ为靶标的AD治疗存在多方面不足，因此需要找到一种副作用小又能有效去除脑实质Aβ的方法。基于最近对脑实质类淋巴系统和脑脊液在脑内物质运输方面的新发现，以及微透析采样技术的优点与缺点，本申请提出微净化去除脑脊液Aβ，进一步去除脑实质Aβ的研究方法。首先制备Aβ纳米抗体，并以此为配基制备吸附剂；再将吸附剂灌注到微透析管路内，制备出Aβ微净化系统；然后将不同类型和浓度的Aβ聚集体注射到不同年龄大鼠脑实质不同部位，借助微净化系统，吸附去除脑脊液Aβ。本研究提供了一种新的脑脊液致病因子去除方法，并为能否通过该方法吸附去除Aβ和把握AD治疗时机提供依据。

以Aβ为靶标的阿尔茨海默病（AD）治疗效果不理想使大家对Aβ是否是AD发生发展的诱导因素提出了质疑，仔细分析发现以Aβ为靶标的AD治疗存在多方面不足，因此需要找到一种副作用小又能有效去除脑实质Aβ的方法。本申请提出借助微净化系统，去除脑脊液Aβ的新方法。首先，用Aβ抗原免疫羊驼后，获得淋巴细胞mRNA，建立T7噬菌体展示纳米抗体文库，测序结果表明，免疫库多样性为2.0X107。为了保持Aβ的正确构像，采用Aβ末端引入巯基标签的方法将Aβ与马来酰亚胺基团反应，实现Aβ单体和寡聚体的定向固载，最佳固载pH为6.95，且加入还原剂有利于提高固载效果。噬菌体-ELISA后，获得4条纳米抗体序列。为了获得足够的纳米抗体用于吸附剂的制备，采用3种大肠杆菌宿主、六种表达载体对纳米抗体的制备条件进行了优化，结果表明E.coli Shuffle T7 (DE3)更利于纳米抗体的表达，与促进溶解的蛋白融合表达能提高纳米抗体的可溶表达量。纯化后所获得的纳米抗体不仅能识别Aβ单体、寡聚体和纤维，还对Aβ单体的聚集和纤维化有抑制作用,对已形成的Aβ纤维有解聚作用。为了便于蛋白固载效率的检测，本申请在定向固载纳米抗体前首先以融合有His标签的生物素连接酶（BirA）为模式蛋白进行了蛋白定向固载条件的研究。经过条件优化，确定首先将BirA吸附在耦合有Co2+的NTA表面，然后10 mM H2O2氧化 90 min，再经10 mM EDTA和50 mM咪唑洗脱，最终蛋白被稳定固载在琼脂糖凝胶颗粒表面，固载蛋白循环使用10次或4℃贮存20 天后，仍表现出很好的催化活性。 最后根据上述优化条件定向固载了融合有His标签的Aβ纳米抗体，每毫升NTA-琼脂糖凝胶能固载20.7 mg纳米抗体，饱和吸附为1.98 mg，体外实验表明固载的该纳米抗体除了具有Aβ吸附能力，且不再被能识别His标签的二抗结合，能同时实现Aβ纳米抗体的吸附去除和夹心ELISA检测。APP转基因鼠微透析实验结果表明，该方法能有效吸附去除脑脊液内Aβ，2小时内约去除40%-50%。本申请的研究成果为寡肽的纳米抗体筛选策略，纳米抗体更有效用于夹心ELISA检测时的抗体固载策略，以及脑组织可转运有毒多肽或蛋白去除策略等提供了参考。