网状内皮增生症病毒（REV）劫持外源体（Exosome）途径逃逸免疫监视的机制研究

近年来禽群中REV阳性感染率不断上升，诱导免疫抑制对养禽业的危害日益严重，由于引起免疫抑制的机制不甚清楚，目前无有效疫苗或药物防控。外源体（Exosome）是起源于晚期内含体的膜性小囊泡，其成分及分泌过程与反转录病毒非常相似，反转录病毒劫持exosome途径逃避免疫监控的假说已被证实。但病毒何以劫持exosome途径以感染细胞？不得而知。本研究通过对不同来源exosome蛋白组分比较，筛选差异蛋白；研究exosome对T淋巴细胞的影响，明确何种细胞分泌的exosome引起T细胞免疫抑制；电镜超微观察，确定REV出芽和差异蛋白的亚细胞定位；分析可能与REV劫持exosome途径密切相关蛋白，RNA干扰抑制蛋白表达，确定其对exosome途径及REV感染的影响。明确REV劫持exosome途径以感染细胞的机制，为阐明exosome在REV感染机制中的作用，探索阻断REV感染新方法奠定了基础。

近年来禽群中REV和ALV-J阳性感染率不断上升，诱导免疫抑制对养禽业的危害日益严重，引起免疫抑制的机制不甚清楚，目前无有效疫苗或药物防控。外源体（Exosomes）是起源于晚期内含体的膜性小囊泡，其形成过程与反转录病毒非常相似，反转录病毒劫持exosomes 途径逃避免疫监控的假说已被证实。但病毒何以劫持exosomes 途径以感染细胞？不得而知。本研究通过分离纯化REV和ALV-J感染与未感染细胞来源的exosomes，电镜观察其形态，质谱分析不同来源exosome 蛋白组分，筛选差异蛋白，Western blot进一步病毒蛋白成分的存在；进而通过流式细胞仪分析不同来源exosome对脾脏来源T 淋巴细胞的免疫调节作用；分析可能与病毒劫持exosome 途径密切相关蛋白，RNA 干扰抑制蛋白表达，确定其对exosome 途径及病毒感染的影响。结果显示，exosomes大小均匀，在100nm左右，形态为杯状，与文献资料报道相一致。病毒粒子和exosomes的共同存在感染细胞胞浆的多囊泡体中，从超微结构说明REV和ALV-J确实参与到了exosomes途径中，并且感染细胞的多囊泡体内小囊泡的数量明显多于未感染细胞，暗示病毒的感染改变了细胞的exosomes途径，促进endosomes的形成和exosomes的分泌。ALV-J感染细胞分泌的exosomes携带gag蛋白和env蛋白的ISD免疫抑制微区，REV感染细胞分泌的exosomes携带env蛋白。有研究显示，感染反转录病毒HIV的T细胞分泌的携带病毒的gag蛋白的免疫抑制微区Nef，并且可以诱导细胞产生免疫抑制。反转录病毒感染细胞分泌的exosomes携带env蛋白属首次发现报道。携带病毒成分的exosomes可以诱导脾脏的CD4+和CD8+T细胞的分化明显被抑制，但是其作用具有一定的浓度依赖性，低浓度时促进，高浓度抑制，且与ALV-J共同作用时，作用效果介于exosomes和ALV-J单独作用之间。暗示exosomes为病毒的感染提供了一个短程作用的免疫抑制微环境，从而为病毒感染创造了条件。RNA干扰结果显示，基于ALV-J的gag和env基因保守序列干扰重组载体可明显抑制ALV-J病毒的复制。该课题研究为阐明exosome 在REV 和ALV-J感染机制中的作用，探索阻断反转录病毒感染新方法奠定了基础