宿主Snapin蛋白与禽网状内皮组织增生症病毒聚合酶PR相互作用抑制病毒增殖机制研究

Polymerase PR is the protease of Avian Reticuloendotheliosis virus (REV),which is closely related to the virus replication in endonuclear of host. So far, there was no relative reports on interaction protein of REV PR at home and abroad. In this study, REV PR protease was used as “bait” to screen CEF cDNA library with yeast two-hybrid technology, in order to identify the interactional host cell protein of REV PR protease. the genes of REV PR was cloned into vector pGBKT7, and the recombinant bait vectors pGBREV-PR was constructed. Then the self-activation and toxicity of the bait vectors were tested using the Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System. Results showed that the three bait vectors have no self-activation and toxicity to yeast cells. A series of experiments such as Co-IP, pull down were used to vertify the interaction between REV PR and Snapin. A series of PR deletion mutants were built to identify the interational region of PR to interact with Snapin. And Snapin overexpression and silent-expression cell lines were built with G-418 screening and shRNA technology. With PR transfection and REV infection in these cell lines, intracellular localization of PR were identified by laser confocal microscopy. The study has great significanc in clarifying the REV genome DNA synthesis mechanism, and revealing the molecular mechanism of host Snapin play the antivirus role by way of interacting with REV PR.

聚合酶PR是禽网状内皮组织增生症病毒（REV）的蛋白酶，与病毒在宿主细胞核内的复制密切相关，目前未见有关REV PR与宿主相互作用的研究报道。本课题以REV聚合酶 PR为“诱饵”，通过酵母双杂交技术筛选CEF cDNA 文库，得到与PR相互作用的宿主蛋白。通过酵母回转实验、免疫共沉淀验证REV 的PR与宿主Snapin 存在相互作用。构建一系列 PR缺失突变体，通过酵母回转实验、免疫共沉淀技术对PR与Snapin相互作用的区域进行定位。构建Snapin稳定表达和沉默表达的细胞系以实现Snapin上调和下调表达， PR真核表达质粒转染细胞后，感染REV，通过激光共聚焦验证PR在细胞内的定位， 研究Snapin 对PR在细胞内定位的调控作用，揭示Snapin 抗病毒作用机制。该研究结果对阐明REV 合成机制，揭示Snapin与PR相互作用抑制病毒复制的分子机制具有重要意义。

前期研究利用酵母双杂交系统筛选到与禽网状内皮组织增生症病毒（REV）蛋白酶PR存在相互作用的宿主蛋白Snapin。由于聚合酶与病毒在宿主细胞内复制密切相关，提示Snapin可能通过与REV 的聚合酶PR相互作用影响REV复制。本项目通过Snapin 与PR 相互作用验证，二者细胞定位情况以及Snapin 基因上调和抑制表达后对REV复制和PR细胞定位的影响，对是否存在上述机制进行探讨。基于已完成的课题研究，主要研究进展如下：1. 通过酵母回返实验和Co-IP实验验证PR与Snapin之间存在相互作用。用激光共聚焦试验证实，体外共转染Snapin 和PR于293T细胞，可见到红色荧光和绿色荧光相互叠加产生黄色荧光，黄色荧光位于细胞核中，证明两者在细胞核中共定位；内源性的 Snapin 与REV PR 共定位于DF-1细胞核中。2.完成Snapin过表达细胞系和沉默表达细胞系的构建、筛选与鉴定，进行REV在两种细胞系中复制情况的研究。与感染对照组细胞相比，过表达感染组细胞中的Snapin mRNA水平显著提高。过表达Snapin基因能显著降低REV的病毒滴度和病毒基因组拷贝数，表明稳定过表达Snapin使REV复制减弱。设计特异性的鸡源Snapin干扰分子，转染 si NA 干扰分子可有效沉默 DF-1 细胞中内源性 Snapin表达。病毒感染实验结果表明，与转染对照组相比，沉默Snapin基因使REV 基因组拷贝数和病毒滴度显著提高，说明沉默Snapin促进 REV 复制。REV感染 DF-1细胞24 h 后，检测Snapin表达情况，结果显示REV感染DF-1细胞可上调Snapin的表达。3.构建PR的截短突变体质粒与 p Snapin-Flag 共转染 HEK293T 细胞，Co-IP 试验结果表明PR 的 N 端结构域是其与 Snapin相互作用的关键区域。基于以上研究结果，后续研究工作将重点关注REV利用其复制相关蛋白与宿主蛋白相互作用逃避机体免疫应答机制。该实验结果和预期研究结果有助于深入了解宿主抗病毒机理，对解析REV复制机制具有重要意义，为揭示REV逃避宿主抗病毒机制提供线索，为研制新型REV防治试剂提供理论依据。