泰乐菌素通过CysM蛋白干预猪链球菌生物被膜形成机制的研究

Streptococcus suis is an important zoonotic pathogen and can form biofilm (BF), causing a persistent infection. The Streptococcus mutans and Vibrio fischeri BF formation may be related to the cysteine synthesis pathway, and O-acetylserine hydrogen sulfide enzyme B (CysM) is one of the key enzymes which plays an important role in the cysteine synthesis. In our previous study, the proteomics data of tylosin inhibiting the Streptococcus suis biofilm formation indicated that CysM was down-regulated. It is suggested that CysM may regulate the formation of S. suis BF, and CysM may act as a target. Therefore, this project intends to clarify the role of CysM in the formation of BF by gene knockout and complementation techniques; Choosing CysM as a targe，explain the regulation of tylosin on CysM from protein level, gene level, enzyme activity, content of cysteine and biofilm formation; Based on molecular docking technology, combined with surface plasmon resonance technology, amino acid site-directed mutagenesis test and enzyme activity test to confirmed the target of tylosin and clarified the mechanism of tylosin inhibited the S. suis biofilm formation. This project provides a theoretical basis for solving the problem of persistent infection by Streptococcus suis.

猪链球菌不仅是一种重要的人畜共患病病原菌，且可以形成生物被膜（Biofilm, BF），造成感染迁延不愈。半胱氨酸调控变形链球菌、费氏弧菌BF的形成， 而O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B（CysM）是半胱氨酸合成通路关键酶之一。前期试验表明，泰乐菌素干预猪链球菌BF时，CysM显著下调，提示CysM可能调控了猪链球菌BF的形成，泰乐菌素可能以其为靶标发挥作用。为阐明该假设，本项目拟通过基因敲除及回补技术，阐明CysM在猪链球菌BF形成中的作用；在泰乐菌素干预下，以CysM为靶标，从蛋白、基因、酶活性、半胱氨酸含量及BF形成揭示泰乐菌素对CysM的调节作用；基于分子对接技术，结合表面等离子共振方法、氨基酸定点突变和酶活性试验，确定泰乐菌素的作用靶位，阐明泰乐菌素干预猪链球菌生物被膜形成的机制，为解决猪链球菌感染久治不愈的问题提供理论依据。

猪链球菌(Streptococcus suis，S. suis)是一种重要的人畜共患病病原菌，对人和猪的健康安全危害严重。猪链球菌能够形成生物被膜（Biofilm，BF），形成BF的细菌具有高度的耐药性并能逃避免疫系统的攻击，使感染久治不愈。因此，对猪链球菌生物被膜调控机制的研究及寻找新型药物作用靶标，已成为国内外科研工作者关注的重点之一。半胱氨酸合成酶（CysM）作为半胱氨酸生物合成途径中的关键酶之一，其在哺乳动物的细胞中不存在，所以被认为是潜在的药物靶点。泰乐菌素作为大环内酯类药物中的一种，被广泛应用于兽医临床中，前期研究表明泰乐菌素具有干预猪链球菌生物被膜形成的作用，但是否以CysM为作用靶点还未见报道。因此，本研究通过探究泰乐菌素以CysM为靶标揭示对猪链球菌生物被膜的干预作用，阐明泰乐菌素干预猪链球菌生物被膜形成的机制。试验结果表明，CysM对猪链球菌生物被膜的形成具有重要作用，且是泰乐菌素作用的靶标，泰乐菌素通过调节cysM基因和CysM蛋白的表达及半胱氨酸生物合成途径中相关基因的表达水平、酶的活性变化和关键代谢产物含量的变化以及直接与CysM作用抑制酶活性来影响猪链球菌生物被膜的形成。故本研究从CysM靶点角度出发，阐明了泰乐菌素干预猪链球菌生物被膜形成的机制，从抑制靶标蛋白的角度提供了控制生物被膜感染的理论基础，增进我们对以CysM为靶点抑制剂的认识。