腈水解酶催化形成酰胺副产物的分子机制研究及其双向改造

Nitrilases have attracted substantial attention as valuable alternatives to chemical catalysts. With the in-depth study of the nitrilase, more nitrilases were found to have nitrile hydratase activity, producing amide as by-product in the hydrolysis process. The formation of amide has become an important factor limiting their industrial applications. However, it also provides an important route for the synthesis of amide. Highly selective arylacetonitrilase-mediated amide synthesis, would afford a synthetic route to enantiomerically pure amides. As such, it could be a valuable addition to the synthetic repertoire.Based on these, using arylacetonitrilase which have nitrile hydratase activity as the research target, we try to analyze the structural features of nitrilase, explore the model of binding substrate to the enzyme and identify the key amino acid residues and structural domains by combination bioinformatics and experimental tools, reveal the molecules mechanism that nitrilase-catalyzed formation of amide, thus providing a theoretical basis for the rational design of nitrilase. Subsequently, molecular modification based on rational design was used to engineering the nitrilase to produce amide or carboxylic acid respectively, extending the scope of application of the nitrilase.

腈水解酶作为一种有价值的化学催化剂的替代品备受人们的关注。随着对腈水解酶研究的深入，越来越多的腈水解酶被发现有腈水合酶活性，水解过程中会产生酰胺副产物。酰胺副产物的存在已经成为限制其工业化应用的一个重要影响因素。但同时也为酰胺的合成提供了一条重要的途径。将具有高度选择性的芳基乙腈族腈水解酶应用于酰胺合成中，可以得到一个全新的高纯度对映体酰胺的合成路线，这将成为合成领域一个非常有价值的项目。基于此，本项目拟以具腈水合酶活性的芳基乙腈族腈水解酶作为研究对象，通过生物信息学等手段分析腈水解酶的结构特征，探索底物与酶的结合模式，结合实验学手段准确定位关键氨基酸残基和结构功能域的作用，揭示腈水解酶催化形成酰胺的分子机制，进而为腈水解酶的理性改造提供理论依据。通过分子改造，实现腈水解酶催化酰胺的活性控制，完成腈水解酶专一性催化生成羧酸或酰胺的双向设计，为腈水解酶的高值化利用奠定基础。

本项目以酶功能与结构关系为研究对象，针对“腈水解酶水解形成酰胺副产物的成因”这一科学问题，利用具有高腈水合酶活力的腈水解酶为研究对象，结合腈水解酶水解催化机理，从底物性质及酶分子结构两个方面对影响腈水解酶产物专一性的关键因素及机制进行研究，并通过酶的人工定制，在同一母体上实现腈水解酶催化生成酰胺/羧酸的双向改造。具体研究结果如下：.一、采用基于系统进化分析的底物特异性预测法与传统的基因挖掘技术相结合，获得了具有较高腈水合酶活力的腈水解酶NIT43949。对苯乙腈及其α碳位上不同取代基的衍生物水解反应显示，产物羧酸和副产物酰胺的生成量受R基团大小及电子效应的影响。R基团越大，酰胺生成量越小。R基团为吸电子基团时，会破坏四面体过渡态中反应物氮原子上所带的正电荷的稳定性，使反应朝有利于酰胺的形成。.二、通过蛋白结晶及X-射线衍晶体解析技术获得了国际上第二个腈水解酶的晶体结构，利用虚拟突变、量化计算、分子对接、分子动力学模拟等技术，解析了腈水解酶多功能反应的调控机制在于催化过程中过渡态四面体上氨基与巯基的质子化竞争。获得的193位关键位点，它以空间位阻的模式，影响周围氨基酸的构象、氢键、静电作用及芳香作用，进而影响了过渡态中间四面体上巯基和氨基的质子化竞争，最终影响产物中酰胺和羧酸的比例。.三、采用分子改造的手段实现了腈水解酶产物专一性的改造。获得的两个突变体W187P/N205C和W187P/N205S，其水解产物中酰胺的占比量均达到了97.4%，实现了腈水解酶到腈水合酶的功能切换。同时将获得的关键氨基酸应用于具有高立体选择性的水解酶BCJ2315上，突变体W188K所产生的酰胺从野生型的小于1%提高到了77%。尤为重要的是，酰胺的ee值高达99.6%。该研究成果赋予了腈水解酶更多的应用价值，开创性地为酰胺，尤其是光学纯酰胺的合成提供一条全新的途径。在羧酸生成途径改造中，我们获得的W164A突变体，其酰胺的生成量从野生型的46.2%降到了5.3%，基本上阻断了酰胺合成途径，实现了羧酸的产物专一性的改造。