腈水解酶催化潜手性二腈化合物去对称性水解反应的立体识别机理研究

Chiral cyanocarboxylic acid is the key intermediate for the synthesis of pharmaceuticals. One of the method for their preparation is the desymmetric hydrolysis of prochiral dinitrile compounds catalyzed by nitrilases. Some nitrilases catalyze the hydrolyse of prochiral dinitriles to give cyanocarboxylic acids, but the hydrolysis reaction of chiral selection mechanism has not been reported. In this project, the hydrolysis of prochiral glutaronitriles with different 3-substituents catalyzed by different nitrilases will be studied by measuring the enzyme activity, enzyme kinetic parameters and the ee values of the hydrolysis products, to determine the effects of 3-substituent in glutaronitrile on the stereoselectivity of these nitrlases.; By simulating the nitrilase structureand enzyme-substrate docking studies, the interactions of the nitrilases and the substrates will be explored to understand the stereo-recognition mechanism in the desymmetric hydrolysis of 3-substituted glutaronitriles.Based on these understanding, further design and engineering of nitrilases will be performed in order to obtain the enzymes for more efficient desymmetric hydrolysis of the prochiral glutaronitrile or dinitrile compounds with longer carbon skeleton, laying the foundation for realizing the enzymatic manufacturing of chiral cyanocarboxylic acids

手性单氰基羧酸是手性药物合成的关键中间体，腈基水解酶对潜手性二腈化合物的选择性水解是其制备的有效方法。有些腈基水解酶对潜手性二腈化合物进行去对称性水解，产生高手性的氰基羧酸，但这一水解反应手性选择机理还没有报道。本项目将以腈基水解酶和潜手性3-位不同取代基戊二腈为研究材料，通过腈基水解酶对潜手性戊二腈底物的水解反应的酶活性、酶动力学参数和水解产物的ee值测定；采用酶分子结构模拟、酶-底物对接等技术方法，探索腈基水解酶、底物结构与去对称性水解反应产物高立体选择性的相互关系，扩大现有对酶的立体选择性研究的视野，阐明腈基水解酶催化戊二腈基化合物去对称性水解反应的立体选择性机理。为进一步设计改造腈基水解酶，以期获得对有应用价值的潜手性戊二腈化合物或碳骨架更长的二腈化合物的去对称性水解更高效、立体选择性更高的酶催化剂，达到为实现手性单氰基羧酸酶法绿色制造奠定基础的目的。

手性单腈基羧酸是手性药物合成的关键中间体，腈基水解酶对潜手性二腈化合物的选择性水解是其制备的有效方法。在本项目的支持下，我们开展基因数据库挖掘、克隆、表达，建立了一个含近100种腈水解酶的酶库，并对二腈化合物进行了筛选测定，发现13种对二腈类化合物具有水解能力；进一步研究了这些酶对3-取代腈类化合物和对苯二腈化合物的水解性质及应用；确定了以来源于Synechocystis sp.strain PPCC6803的腈水解酶（SsNIT）开展对潜手性3-位不同取代基戊二腈水解酶的研究工作，并进一步测定了酶活性、酶动力学参数和水解产物的ee值，积累了丰富的实验数据。将底物3-(4-氯苯基)-戊二腈与腈水解酶（SsNIT）进行分子对接，采用半理性设计及饱和突变的方法，获得一个对3-(4-氯苯基)-戊二腈类化合物展现优良水解活性及更高立体选择性的突变体，它催化水解3-(4-氯苯基)-戊二腈类化合物的最高时空产率超过野生型酶30倍以上；通过深入模拟分析发现，酶底物结合口袋发生了改变，被扩大的活性中心区域及活性口袋入口是突变体酶活性提高的原因。这为高效率、高立体选择性合成手性光学纯γ-氨基丁酸类原料药奠定了坚实的基础。对该酶进行了更进一步的分子改造，分析了影响腈水解酶催化 3-位取代戊二腈化合物去对称水解反应活性及立体选择性的关键氨基酸位点，通过这些位点的氨基酸突变进行改造，获得有益突变体，研究了腈水解酶催化3-位取代戊二腈化合物的去对称水解反应的影响因素，实现了催化 3-位不同取代戊二腈底物去对称性水解的活性的提高和立体选择性的翻转，达到了催化潜手性二腈化合物的去对称性水解和高手性单腈单酸化合物的高效合成目的，并建立了普瑞巴林“化学-生物催化”合成工艺。发表研究论文4篇，申请中国发明专利3项。.本项目获得了一个具有水解二腈化合物的腈水解酶晶体结构，分辨率为2.5 Å，腈水解酶晶体结构报道极少，这为后续深入研究工作奠定了结构基础。