基于人源性FGF23基因C35A突变Knock-in小鼠研究下颌前突致病机制

Mandibular prognathism（MP）is a kind of developmental craniofacial deformity, prevailing in more than 10% of the Chinese Han population, and seriously affects oral function and facial appearance of the affected individuals. MP is suggested to be caused by both hereditary and environmental factors. Although has been extensively investigated, the MP-causing gene has not been well defined. Our previous study identified a putative MP-causing mutation, C35A in FGF23 gene, by family linkage analysis. This mutation impaired the secretion of FGF23 protein in transfected 293T cells. We have also established a FGF23 C35A Knock-in mouse model expressing human mutant FGF23 signal peptide by CRISPR/Cas9 technique. Basing on our preliminary studies, this proposal intends to further investigate the function and mechanism of FGF23 C35A mutant in the pathogenesis of MP using radiography, immunohistochemistry, and molecular biology, from macroscopic to microscopic perspectives. The experimental results will provide a reliable theoretical basis of prevention, diagnosis and treatment of MP.

下颌前突（Mandibular prognathism, MP）是一类常见颌面部发育畸形，在我国发病率超过10%，严重影响患者口颌功能和颜面美观。通常认为MP是由遗传和环境因素共同作用引起的。近年来国内外学者对MP的遗传因素进行了大量研究，但至今尚未确定致病基因。本课题组通过家系连锁分析发现一个MP可疑致病突变基因FGF23，突变位点为C35A，并在转染的293T细胞中证实该突变可干扰FGF23蛋白分泌。为了进一步明确该突变对于MP发生的作用，我们通过CRISPR/Cas9技术成功构建了人源性FGF23 C35A突变Knock-in小鼠。本项目将以此为基础，利用模式小鼠，通过影像学、免疫组织化学、分子生物学等技术，从宏观到微观各层面解析此突变基因对颅颌面的影响，阐明FGF23 C35A突变对于MP发生的作用机制。研究结果将为MP的预防、诊断和治疗提供理论依据。

本课题组根据前期在一个下颌前突家系中发现的可疑致病基因FGF23的突变位点C35A，在模式动物层面探索该突变在下颌前突发生发展过程中的作用。我们成功构建CRISPR/Cas9系统同源重组Knock-in小鼠，并对突变小鼠颅颌面骨、成骨能力、成软骨分化、钙磷代谢及骨骼矿化的情况进行了研究。我们发现敲入未突变人源性 FGF23 基因的小鼠与野生型表现一致，而敲入人源性 FGF23 C35A基因的小鼠表现出下颌前突的表型，证明本研究所采用的人源化技术不改变小鼠表型，造成的差异是由FGF23 C35A突变造成。我们继而发现突变小鼠下颌骨体部骨小梁增厚，且髁突软骨成骨能力增强，但髁突破骨能力无显著变化。对小鼠血清检测发现FGF23蛋白显著减少，说明突变之后影响该蛋白的分泌，并发现全身钙磷含量和全身骨密度升高。通过细胞实验发现突变可以抑制颅骨细胞的增殖，位点突变FGF23在颅骨细胞中上调了FGFR3的表达，并可能通过MAPK信号通路促进颅骨细胞分化。