在TNNI2突变基因Knock-in小鼠模型中探索远端关节弯曲发病机制的研究

远端关节弯曲(DA2B)是常染色体显性遗传病，本室及合作者的前期研究显示TNNI2基因突变是导致DA2B遗传病因之一，然该突变基因的致病机理不清。为研究TNNI2突变导致DA2B的发病机理，在我们利用基因打靶技术制造了TNNI2del175k knock－in小鼠模型，成功复制出DA2B疾病表型的基础上，拟在全身、组织和分子水平，观察del175k基因突变对小鼠身材矮小表型的影响，检测基因突变小鼠骨发育和发生的病理改变，通过表达谱芯片、real-time PCR、组织原位杂交和骨修复技术阐明基因突变可能产生的分子变化及其相互作用。为诠释TNNI2del175K knockin小鼠发生DA2B的原因，揭示人DA2B的发病机制，提供新的实验证据和理论依据。因此，拟定研究对DA2B的临床诊断和药物靶标具有潜在的应用价值。

远端关节弯曲2B型（Distal arthrogryposis type 2B，DA2B)是一种罕见的单基因遗传病。主要的临床表型为手足的挛缩畸形，三角脸，脊柱后突畸形和身材矮小。目前的研究发现遗传学病因学突变主要集中于TNNI2、TNNIT、TROPOMYOSIN和MYOSIN等一组与骨骼肌收缩相关的基因。为了研究单基因突变导致DA2B的发病机理，我们利用基因打靶技术在小鼠Tnni2基因中定点引入了一个人类DA2B点突变（TNNI2K175del）。Tnni2K175del 突变鼠模型（我们命名为DA2B鼠）成功地复制出人类DA2B的主要临床表型。我们观察到DA2B鼠的个体明显小于同窝的野生型小鼠。由于既往研究显示TNNI2主要生理功能在于调节肌小节的收缩，我们推测TNNI2可能通过某种未知的功能参与机体的发育。因此，本研究主要集中于探索Tnni2K175del 突变导致DA2B鼠个体矮小的发病机理。我们的研究结果显示， Tnni2蛋白表达于小鼠长骨生长板的软骨细胞和成骨细胞。长骨的表达谱分析显示，突变鼠的Hif3显著地高于同窝的野生型对照组小鼠，而Vegf及其受体Flt1明显地低于野生型对照组小鼠。通过体内的小鼠原代成骨细胞染色质免疫共沉淀实验、体外的DNA pull-down和EMSA实验，我们证实突变型和野生型Tnni2均结合Hif3启动子区。荧光素酶报告基因实验显示K175del突变型Tnni2蛋白对Hif3启动子区的调节能力明显高于野生型蛋白，该结果提示K175del点突变增强了Tnni2对Hif3的转录调节活性。在DA2B鼠的生长板中，增加的hif3，抑制了hif1对vegf转录调节，vegf的减少损害了突变鼠长骨的血管生成，削弱了软骨细胞的分化，成骨细胞的增殖以及延迟了软骨内成骨。结论：我们的研究数据显示Tnni2能够调节骨发育。Tnni2K175del突变阻碍小鼠骨发育导致DA2B鼠个体矮小为研究人类DA2B的发病机理提供了思路。