基于人源化小鼠研究MDR1基因多态性对耐药性癫痫的影响及其机制

Epilepsy is a major neurological disorder, affecting more than 50 million people worldwide. Antiepileptic drugs (AEDs) do not effectively treat 30-40% of patients. Gene polymorphisms of MDR1 1236C>T, 2677G>T and 3435C>T have been associated with drug-resistant epilepsy. However，there is no in vivo or in vitro evidence to demonstrate that these polymorphisms can affect the generation and risk of drug-resistant epilepsy in animal models. We have established an effective cell monolayer model and found that 2677G>T and 3435C>T can improve the transport function of P-gp. Therefore, we hypothesize that MDR1 gene polymorphism can affect the expression or function of P-gp, limit the concentration of AED in brain, and cause the drug-resistant epilepsy. We propose to use P-gp humanized mice containing MDR1 polymorphisms (1236C>T, 2677G>T, and 3435C>T) to investigate: 1) the effect of MDR1 polymorphism on the rate of drug-resistant epilepsy, and the efficacy and brain distribution of AED; 2) the influence of MDR1 polymorphisms on the expression and transport function of P-gp; 3) the molecular mechanisms underlying polymorphism-mediated change of P-gp function. This study may demonstrate the direct effect of polymorphism on drug-resistant epilepsy and provide a molecular explanation of the association between the polymorphisms and pharmacoresistance. This study will clarify the mechanism of the association between MDR1 polymorphism and drug resistance epilepsy, and provide a theoretical basis for clinical diagnosis, personalized medicine and new drug development.

多药耐药基因MDR1基因多态性与耐药性癫痫密切相关，但其影响癫痫耐药性的机制尚不清楚。迄今没有明确的动物或体外证据阐明MDR1基因多态性如何影响耐药性癫痫的发生。我们前期在细胞模型中发现MDR1多态性可以影响P-gp（MDR1的产物，能转运多种AED）转运抗癫痫药物（AED）。因此，我们推测MDR1多态性通过改变P-gp的功能影响AED的脑内分布，导致癫痫耐药性。本项目拟利用含有MDR1多态性（1236C>T、2677G>T、3435C>T）的P-gp人源化小鼠，研究正常和癫痫状态下MDR1基因多态性对耐药性癫痫的影响及其机理：检测MDR1多态性对耐药性癫痫发生、AED疗效、AED脑内分布的影响；检测基因多态性对P-gp表达和功能的影响；探索基因多态性影响P-gp表达和功能的分子机制。该研究将阐明MDR1多态性与耐药性癫痫相关联的机理，为临床诊断、个性化用药、新药开发提供理论依据。

癫痫是严重的慢性神经系统疾病，全球有约 6800 万癫痫患者，其中约30%为耐药性癫痫。多药耐药基因ABCB1基因多态性与耐药性癫痫密切相关，但其影响癫痫耐药性的机制尚不清楚。迄今没有明确的动物或体外证据阐明ABCB1基因多态性如何影响耐药性癫痫的发生。在本项目中，我们构建了Abcb1a/b基因敲除小鼠、人源化ABCB1小鼠、及其相对应的含有ABCB1多态性位点（1236C>T、2677G>T、3435C>T）的ABCB1人源化小鼠。检测了ABCB1基因多态性对P-gp表达和功能、抗癫痫药物脑内分布、药代动力学的影响，探索了基因多态性影响P-gp功能的分子机制。在该项研究中，我们成功构建了Abcb1a/b基因敲除小鼠、ABCB1人源化小鼠及其相对应的含有点突变的ABCB1人源化小鼠，并验证了人源化小鼠中的P-gp具有功能。利用这三个品系的小鼠，首次在P-gp人源化小鼠上研究了ABCB1基因多态性如何影响抗癫痫药物的转运，发现1236C>T、2677G>T、3435C>T并不影响P-gp 的表达和组织定位，但ABCB1基因多态性在一定程度上影响了抗癫痫药物（奥卡西平）的血药浓度、药代动力学曲线、脑组织分布，提示基因多态性影响了抗癫痫药物的整体药代动力学和跨血脑屏障转运。同时，通过细胞实验、计算机三维蛋白结构模拟和分子对接实验，我们发现ABCB1基因多态性对不同抑制剂在抑制P-gp功能方面会有不同影响; 1236C>T、2677G>T、3435C>T会影响P-gp跨膜转运抗癫痫药物; ABCB1基因多态性影响了P-gp的底物结合口袋的三维结构及其与底物的结合能力，进而提示ABCB1基因多态性在影响抗癫痫药物的疗效中的重要作用。该研究在一定程度上阐明了ABCB1多态性与耐药性癫痫相关联的机理，对揭示多态性位点如何影响P-gp功能及其转运抗癫痫药物的能力具有一定的价值，在一定程度上推动了耐药性癫痫的机理研究，对于耐药性癫痫的诊疗具有重要的现实意义。