EHBP-1功能域作用机制及其突变体对兴奋毒神经元坏死的抑制效应

Ischemic stroke causes hypoxic conditions in the brain, leading to acute glutamate buildup and GluRs overactivation on neighboring neurons, resulting in excitotoxicity and neuronal necrosis. Negatively regulated recycling trafficking of GluRs out of synaptic membranes can protect neurons from excitotoxicity, and has potential clinical applicability for mitigating excitotoxic damage during stroke. Our previous studies revealed that EHBP-1 is the specific regulator of GLR-1 recycling trafficking. Despite these insights, much is unknown with respect to the mechanism by which EHBP-1 regulates membrane trafficking. To better understand how EHBP-1 regulates recycling of GLR-1, we propose to conduct structure-functional analysis on the predicted C2 and CH domain of EHBP-1 to elucidate their functional mechanisms and importance. Additionally, we will examine the inhibitive effects of EHBP-1 domain mutants on GLR-1 synaptic localization under hypoxia and excitotoxicity-induced necrosis. Our proposed studies are expected to provide supportive evidences for the functional model of coordinate interplay between protein regulators/intracellular membrane/cytoskeleton in membrane trafficking modulation. Furthermore, our studies serve as useful clues in the development of trafficking based clinical intervention strategies for ischemic stroke induced excitotoxicity and necrosis.

缺血性脑卒中直接导致脑缺氧、谷氨酸急性累积和谷氨酸受体 (GluRs) 过激活，诱发兴奋性神经毒及神经元坏死。通过对GluR循环运输的抑制，可减少突触后膜上的GluR数量，减轻兴奋毒伤害，具有潜在的临床价值。我们的前期工作证明线虫EHBP-1特异性调控AMPA类型谷氨酸受体 (GLR-1) 的突触循环运输，但其具体的分子调控机理尚不清楚。为深入了解GLR-1循环运输调控机制，本项目拟对EHBP-1进行结构功能分析，阐明EHBP-1中的N末端C2域、中部CH域的作用机制及其功能重要性，并探讨EHBP-1功能域突变对缺氧环境中突触GLR-1表达和兴奋毒神经元坏死的抑制效应。本项目将为蛋白因子/细胞内膜/细胞骨架协同调控膜蛋白运输这一细胞学理论提供实验依据，从GLR-1循环运输调控的角度为脑缺血引发的兴奋毒神经元坏死的干预治疗提供新的策略。

真核细胞的内吞途径对大分子、液体、膜和膜蛋白的内吞和运输非常重要。内吞途径中最缺乏了解的一个通路是内吞循环路径。内吞循环是将内吞的大分子（通常是受体）和胞外液体从内涵体送回到质膜。在以前的研究发现，小GTP蛋白RAB-10是调节内吞循环的关键蛋白。RAB-10作用于RME-1的上游，调节肠细胞中的基底循环和中间神经元中的突触后蛋白循环运输。EHBP-1/Ehbp1是RAB-10 /Rab10的效应因子，是一个保守的内吞循环调控蛋白。ehbp-1突变有着和rab-10突变一样的内涵体形态和货物蛋白定位缺陷。EHBP-1含有三个结构域：N端的类C2结构域，中间的细胞骨架结合CH域 (Calponin Homology Domain) 和C端的螺旋-螺旋域。现有研究证明EHBP-1是通过其C端的螺旋-螺旋域介导了与RAB-10(GTP) 的结合，但EHBP-1具体的分子调控机理尚不清楚，需开展结构功能研究来解析其功能机制。在本研究中，我们发现EHBP-1通过N端的类C2结构域与富含phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) 的膜结构结合，并通过氨基酸定点突变确定了NT-C2中介导膜结合的关键氨基酸。另外，EHBP-1中间的CH结构域能够与微丝结构结合，值得注意的是，这种结合能够被RAB-10(GTP) 促进。在线虫肠上皮细胞中，RAB-10/EHBP-1系统的任一成员缺失都会导致基底循环货物蛋白滞留在内涵体，并且这些内涵体无法形成正常的管网状结构。因此，我们提出这样一个假设： EHBP-1将内涵体膜结构与微丝骨架连接起来以促进内涵体形成管状结构，RAB-10(GTP) 促进了这一过程。我们的结果显示，局部微丝网络能够稳定参与循环货物分类和运输的管状内涵体结构域。