ANXA7对癫痫发作神经元兴奋性的影响及其可能机制

In the earlier study, we have found that the expression of ANXA7 in the brain of patients with intractable epilepsy and pilocarpine-induced seizures in rats was both higher than the control respectively, and it localized in the cytoplasm of neurons. ANXA7 is a member of the family of annexins, which are thought to function in the regulation of calcium homeostasis and the fusion of vesicles. Many studies have shown that seizures can lead to the dynamic change of [Ca2 +] i and calcium overload. Our study will be to investigate the impact of ANXA 7 on the neuronal excitability of seizure disorder, and its possible mechanism. We will establish the epilepsy model of animal and cell, then test the ANXA7,PLC/IP3R,sorcin/ryanodine by co-immunoprecipitation，immunohistochemistry, western-blot and so on, observe the dynamic change of [Ca2 +] i by laser confocal microscopy, and detect the membrane potentials of hippocampal neurons by patch clamp. In the study, we will found that the mechanism of the ANXA7 to seizures may be to promote the calcium overload by PLC/IP3R, sorcin / ryanodine pathway, lead to the neuronal damage and change the plasticity.

前期的研究显示，ANXA7在难治性癫痫患者颞叶脑组织中和氯化锂-匹罗卡品诱导的慢性癫痫大鼠脑组织中均大量表达，且其主要存在神经元的胞浆内。ANXA7是膜联蛋白家族中的一员，是依赖Ca2+的磷脂结合蛋白，主要功能是调节细胞内钙稳态和胞吐等。大量研究显示癫痫发作可导致离体海马神经元内[Ca2+]i的动态变化、钙超载现象的发生。本课题预研究ANXA7对癫痫发作神经元兴奋性的影响及其可能机制。通过建立癫痫动物模型和细胞模型，分别对相关蛋白通过免疫共沉淀、免疫组化、western-blot等方法进行研究，并应用激光共聚焦显微镜观察各组离体海马神经元内[Ca2+]i的变化，应用膜片钳技术观察各组离体海马神经元的膜电位变化。通过本课题研究证明，ANXA7对癫痫发作神经元兴奋性的影响可能是通过PLC/IP3R、sorcin/ryanodine机制促进钙超载现象的发生，导致神经元损伤和可塑性改变。

癫痫是神经系统常见的慢性疾病，它是由各种不同的原因导致的脑功能障碍， 主要表现为正常脑功能的经常发生不可预测的中断。作为威胁生命的脑部疾病，癫痫影响了世界约 5000 万的人口，其中中国癫痫患者约为 900 万人口，给其家庭造成了严重的经济负担，成为亟待解决的社会卫生问题 。膜联蛋白A7（ANXA7）是膜联蛋白家族中的一员，与钙结合后可进一步与酸性磷脂结合，故又被称为钙依赖性磷脂结合蛋白。在前期的基础工作中，我们发现膜ANXA7在难治性癫痫患者颞叶脑组织中和小鼠癫痫模型脑组织中均大量表达，主要存在神经元的胞浆中。故我们后续探讨了ANXA7蛋白是否参与了癫痫的发生发展，以及影响了哪些下游分子从而造成了神经元兴奋性的改变。首先，我们分别构建了ANXA7蛋白过表达病毒及其抑制病毒，分别在氯化锂-匹鲁卡品和海仁酸两种癫痫模型中验证了每组小鼠癫痫发作的潜伏期、发作次数和发作级别的差异均有统计学意义。后用膜片钳技术分别对每组老鼠的海马脑片行AP、mEPSP、mIPSP等电生理检查，发现ANXA7抑制组和过表达组与对照组的差异均有统计学意义。进一步，syncam1是ANXA7的下游蛋白，其可以影响4.1B蛋白直接影响突触后膜NMDA受体的数量，从而影响神经元的兴奋性，我们通过western-blot，RT-PCR等实验技术验证了在癫痫患者及癫痫模型小鼠中syncam1和4.1B均为高表达。通过构建syncam1抑制及过表达病毒分组观察癫痫小鼠行为学及电生理，发现syncam1蛋白表达量的高低可影响癫痫的发生发展，从而支持了ANXA7-syncam1-4.1B的分子通路。综上的实验结果证实了ANXA7蛋白参与的癫痫的发生发展，让我们对癫痫疾病中神经元异常兴奋的机制有了更深入的探索。