PINK1蛋白与BAG5蛋白的相互作用在帕金森病发病机制中的作用研究

BAG5蛋白是我们前期工作中运用酵母双杂交系统筛选出来的PINK1蛋白的相互作用蛋白，并应用免疫共沉淀及体外结合实验证实BAG5蛋白与PINK1蛋白存在相互作用，且存在直接相互作用。本项目在此研究基础上，利用免疫荧光共定位、RNA干扰、免疫共沉淀、体外蛋白结合实验、放射自显影等分子生物学和蛋白质功能研究技术，进一步证实PINK1蛋白与BAG5蛋白的相互作用，确定PINK1蛋白与BAG5蛋白的相互作用结构域，探讨PINK1基因的突变对PINK1蛋白与BAG5蛋白的相互作用及亚细胞分布的影响，确定BAG5蛋白对野生型和突变型PINK1蛋白的稳定性、泛素系统降解及抗氧化能力的影响，明确野生型和突变型PINK1蛋白能否磷酸化修饰BAG5蛋白，鉴定磷酸化修饰位点，进一步探讨PINK1蛋白磷酸化修饰BAG5蛋白的作用，从分子水平深入探讨PINK1蛋白与BAG5蛋白的相互作用在帕金森病发病机制中的作用。

在发现BAG5与PINK1存在相互结合的基础上，应用免疫荧光化学技术证实PINK1与BAG5存在细胞内共定位；应用体外蛋白结合实验证实BAG5与PINK1的结合结构域为BAG5蛋白的第一、第二、第四个BAG结构域及第一第二BAG结构域之间区域，PINK1激酶结构域可与BAG5结合；应用GST Pull-down技术与放射自显影技术，通过γ-32P标记的ATP进行体外磷酸化实验表明PINK1不能体外磷酸化修饰BAG5；应用chase-time技术证实BAG5延长了野生型PINK1降解半衰期，起到稳定野生型PINK1的作用，同时缩短了R492X突变型PINK1的降解半衰期，起到促进R492X突变型PINK1降解的作用；应用脂质体过表达、RNA干扰、免疫共沉淀技术证实BAG5能够对野生型及突变型PINK1泛素化水平进行调节：BAG5能减少野生型PINK1多聚泛素化水平，延缓野生型PINK1泛素化降解，BAG5能增加R492X突变型PINK1多聚泛素化水平，促进R492X突变型PINK1泛素化降解；应用脂质体过表达、RNA干扰、免疫共沉淀技术证实BAG5与Parkin通过不同的途径调节PINK1泛素化降解，二者相对独立的对PINK1泛素化降解过程进行调节；应用脂质体过表达、免疫共沉淀技术证实野生型Parkin减少PINK1泛素化降解，突变型Parkin增加PINK1泛素化降解；应用免疫组织化学、western-blot技术发现MPTP诱导的PD小鼠模型黑质多巴胺能神经元中BAG5及Parkin的表达上调而PINK1表达下调。以上研究提示BAG5与PINK1的相互作用参与了PD的发病机制。