PLA2G6基因变异导致铁代谢异常在神经变性疾病发病机制中的作用

The mutation of PLA2G6 gene can lead to a class of clinical heterogeneity of the disease which can appear in the imaging of iron deposit among brain and underlying mechanism remains unclear. Studies have shown that iron death plays a role in the loss of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Our team also found that inhibition the phospholipase activity of iPLA2β can lead to abnormal intracellular iron transport, suggesting that a decrease in iPLA2β phospholipase activity may lead to disruption of iron metabolism, eventually leading to nerve transsexual. On the basis of the previous studies, this project intends to use the constructed PLA2G6 gene manipulated mouse model and related cell lines, through the intervention of iPLA2β enzyme activity, transfection of viruses with different PLA2G6 mutations and other means, using RT-PCR, Western blot, Immunohistochemistry and other molecular biology methods to determine whether mutation of PLA2G6 lead to iron deposition by abnormal iron metabolism, whether the mutation of PLA2G6 induce iron death pathway or decrease the iron death pathway to lead to ferroptosis. To further explore whether the iron chelator or iron death inhibitor has a therapeutic effect on the neurodegeneration induced by PLA2G6 gene mutation, and to explore in depth the mechanism of the PLA2G6 gene mutation leading to iron deposition and iron ferroptosis.

PLA2G6基因突变所致疾病亚型的临床表现虽然差异大，但影像学上脑内均可有铁沉积的现象，其具体机制仍不明确。研究表明铁死亡在帕金森病多巴胺能神经元丢失中发挥作用，本团队前期亦发现抑制iPLA2β磷脂酶活性可导致细胞内铁转运异常，提示iPLA2β磷脂酶活性下降可导致铁代谢的紊乱，最终导致神经变性。本项目拟在前期研究基础上，利用构建成功的PLA2G6基因操作小鼠模型及相关细胞系，通过干预iPLA2β酶活性、转染携带PLA2G6基因不同突变的病毒等方式，应用RT-PCR、Western blot、免疫组化等分子生物学方法，明确PLA2G6基因变异是否通过铁代谢异常导致铁沉积，是否通过诱导促铁死亡通路或减弱抑制铁死亡通路导致铁死亡，进一步探讨铁螯合剂或铁死亡抑制剂是否对PLA2G6基因变异导致的神经变性具有治疗作用，深入、系统地探讨PLA2G6基因变异导致铁沉积和铁死亡的作用机制。

PLA2G6基因是已明确的常染色体隐性遗传的帕金森病致病基因，其突变可导致一类临床异质性较大神经系统疾病——PLA2G6相关神经变性病（PLAN）。PLAN的发病机制目前尚且不清，可能与PLA2G6基因突变引起铁的沉积相关。本研究以通过成功构建PLA2G6基因敲除小鼠和干扰PLA2G6基因N2A细胞系为基础，应用RT-PCR、Western blot、免疫组化、免疫荧光等分子生物学实验方法，结合铁死亡相关标志物的试剂盒检测，同时对不同月龄的小鼠进行攀爬、平衡木及滚轴等行为学实验，发现PLA2G6基因突变可诱导小鼠中脑黑质多巴胺能神经元发生铁死亡，从而导致相关的帕金森样表现。对PLA2G6基因敲除小鼠腹腔注射铁死亡抑制剂Liproxstatin-1可抑制多巴胺能神经元铁死亡进程，延缓小鼠行为学出现阳性表现的时间。对PLA2G6基因敲除小鼠进行铁代谢通路相关蛋白检测，发现小鼠中脑转铁蛋白受体（TfR）、二价铁转运蛋白1（DMT1）以及膜铁转运蛋白（Fpn）均无改变，而铁重链蛋白（FTH）出现降低，提示PLA2G6基因突变引起铁的沉积与铁的输入或转出无关，而可能与贮铁蛋白的动员相关。进一步研究发现PLA2G6基因突变诱导铁死亡的相关分子机制可能与GSK3β-NRF2通路的激活有关，干扰PLA2G6基因的N2A细胞表现出对铁死亡特异性诱导剂Erastin较高的敏感性，同时出现GSK3β-NRF2通路的激活，利用GSK3β通路抑制剂LY2090314可相对提高GSK3β磷酸化的水平，减轻NRF2的受损，有效抑制铁死亡的进展。将LY2090314与Liproxstatin-1联合应用可能有效改善PLA2G6基因突变所致的神经变性。通过本项研究，本团队深入、系统、全面地探讨了PLA2G6基因变异导致铁代谢异常在神经变性疾病发病机制中的作用，明确了PLA2G6基因突变诱导铁死亡作为PLAN的重要发病机制，其原因可能与GSK3β-NRF2通路的激活，NRF2调控受到抑制造成铁蛋白的动员有关，这些均为PLA2G6突变所导致的神经系统变性疾病尤其是帕金森病的诊断提供了更加深入的研究策略，也为日后探索该类疾病的治疗手段开拓了新的视角。