Caveolin-1及其磷酸化对缺血再灌注脑组织神经血管单元的作用及机制研究

星形胶质细胞和内皮细胞间的正常信号传递是神经血管单元(NVU)的核心部分,决定血脑屏障（BBB）完整性,是缺血性脑卒中神经保护的对象。我们前期研究表明,小鼠脑缺血再灌注后Caveolin-1(Cav-1)及其磷酸化水平明显升高,抑制Cav-1磷酸化可显著降低BBB通透性，降低水肿；并发现与氧化应激有关的NOX2基因敲除可减少刺激诱导的Cav-1磷酸化，提出脑缺血再灌注损伤后Cav-1磷酸化由活化的NOX2介导。本课题拟采用小鼠的大脑和原代培养细胞的缺血再灌注损伤模型，以及内皮细胞和星形胶质细胞的共培养，体内外分别应用Cav-1基因敲除和沉默技术,并通过再表达磷酸化位点突变型Cav-1，深入探讨Cav-1及其磷酸化对缺血再灌注脑损伤后NVU间相互作用的调节机制和与ILK/Akt信号通路的关系。课题的完成将为脑组织NVU的分子调控机制提出新的见解，并为临床治疗学的突破提供新的思路和研究基础。

临床发现，所有在动物脑缺血再灌注损伤实验中证实有效的神经保护剂，疗效并不明显。其中一个重要原因是大多数研究只聚焦于神经元，而对神经元所在微环境的保护尚缺乏足够的认识。寻找具有调控神经血管单元(NVU)的关键信号分子为研究脑缺血再灌注损伤的发病机制开辟了新的思路。NVU中星形胶质细胞和内皮细胞间的正常信号偶联是核心部分,决定血脑屏障的完整性，是缺血性脑卒中神经保护的对象。整合膜蛋白Caveolin-1（Cav-1）在NVU中广泛表达，是细胞质膜微囊caveolae的表面标记蛋白，参与膜泡运输和调控信号转导，Cav-1的磷酸化可以影响其自身的功能，在调节细胞内和细胞间通透性方面发挥重要作用，但其是否在脑缺血再灌注损伤后调节星形胶质细胞和内皮细胞间正常的信号偶联，从而影响脑微血管通透性尚未见报道。本课题体内外分别采用小鼠大脑中动脉阻塞法及原代培养脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞糖氧剥夺法建立脑缺血再灌注损伤模型，并应用Cav-1 shRNA干扰、基因敲除和再表达磷酸化位点突变型Cav-1方法，通过行为学、形态学、免疫组化、分子生物学和细胞共培养等技术，深入探讨Cav-1特别是其磷酸化对缺血再灌注脑损伤后NVU间相互作用的调节和机制。结果表明，内皮细胞中磷酸化Cav-1可能通过直接与紧密连接(TJs)蛋白相互作用降低内皮细胞间TJs的稳定性；而星形胶质细胞中磷酸化Cav-1可通过PI3-K/ILK/Akt信号途径调节MMP-9的合成和分泌，进而间接影响内皮间TJs的稳定性。因此，磷酸化Cav-1是调控NVU中内皮细胞和星形胶质细胞之间信号耦联的关键因子，而单纯保护内皮不恢复星形胶质细胞的正常功能对恢复TJs是不全面的。 另外发现，脑缺血再灌注损伤后Cav-1的磷酸化的调控依赖于NADPH氧化酶NOX2介导的c-Src激酶活化。我们的研究将对NVU各组分调节的分子机制提出新的见解，为今后脑缺血再灌注损伤的治疗提供新的思路和靶点。将来可针对Cav-1及其磷酸化开发相应的药物，使药物到达特定部位，增加Cav-1的表达，而抑制其磷酸化水平。因此，对临床治疗学的突破具有重要的理论指导意义和应用价值。