江米酒凝乳酶分子特征及凝乳作用机制研究

Chymosin is the necessary enzyme in cheese-making. However, cheese industry is seriously restricted in China by the fact that this enzyme has long been relying upon import. Kouwonnailio is a kind of traditional dairy product of China, in which the active milk coagulant has proved to be chymosin by studies. But the milk-clotting mechanism of this particular enzyme is hardly discovered. Jiuqu samples from different areas in China are collected in this program and the microorganism yielding good chymosin are screened. High-cell-density cultivation will be used to produce chymosin, which will be purified by tangential flow filtration (TFF) and high performance liquid chromatography for further research on its enzymatic characteristics and molecular conformation. Nuclear magnetic resonance (NMR) and fluorescence spectroscopy (FS) will be applied to discover the molecular characteristics of the chymosin in association with bioinformatics and molecular simulation. Light scattering (LS) techniques, orbitrap mass spectroscopy (MS), confocal laser scanning microscope (CLSM) and atomic force microscope (AFM) will be used to describe its milk-clotting activity, revealing the mechanism of chymosin-casein micelle reaction causing milk to coagulate. This program aims at exploiting traditional food resources and developing chymosin with independent intellectual property right, which is critical in promoting cheese industry of China.

凝乳酶是干酪生产的必需酶制剂，而我国凝乳酶长期依赖进口，严重制约了我国干酪产业的发展。宫廷奶酪是我国一种以江米酒为凝乳剂传统乳制品，已有研究发现江米酒中的凝乳活性成分是凝乳酶。但目前对该酶的分子特征和酶促凝乳机理仍然了解甚少。本研究从我国不同地区的酒曲中分离筛选得到产凝乳酶性能良好的菌株，通过高密度培养制备凝乳酶，利用切向流超滤膜分离和高效液相色谱技术分离得到高纯度凝乳酶，研究其酶学特性，采用核磁共振、荧光光谱等技术，结合生物信息学和计算机模拟分析，深入研究凝乳酶的分子特征，并分析其溶液构象。采用光散射技术、轨道离子阱质谱技术，结合激光共聚焦和原子力显微技术研究凝乳酶在凝乳过程中的行为特征，深入探究凝乳酶与酪蛋白胶束作用导致凝乳的分子机制。本研究对于深入开发我国传统食品资源，促进具有自主知识产权凝乳酶的研发，加快我国干酪产业的发展具有重要意义。

凝乳酶是干酪生产的必需酶制剂，而我国凝乳酶长期依赖进口，严重制约了我国干酪产业的发展。已有研究表明酒曲酿酒凝乳的活性成分是凝乳酶，目前对该酶的分子特征和酶促凝乳机理仍然了解甚少。本研究从我国不同地区的酒曲中分离筛选得到产凝乳酶性能良好的菌株：甲醇芽孢杆菌LB-1和枯草芽孢杆菌LB-2，通过测定凝乳活性和蛋白水解活性曲线发现，发酵24h时凝乳活性最高，分别为269.66±0.78 SU/mL和187.50±1.4 SU/mL，此时的蛋白水解活性分别为1.476±0.49 U/mL和1.29±1.41 U/mL，MCA/PA值分别为187.50和145.34。通过对培养条件进行优化，凝乳活性提高到优化前的2.14倍。经分离纯化后获得的凝乳酶活性为597310±0.13SU/g，且该酶的最适温度为50℃，最适pH为6.5。该酶在中性pH条件下稳定，且浓度为25mmol/L的氯化钙能显著提高该酶的凝乳活性，酶促反应动力学研究结果表明甲醇芽孢杆菌凝乳酶的Km为0.93 g/L，Vmax值为20.49 mL/U。LC-MS蛋白质谱将该酶鉴定为ID I3EB99，含有759个氨基酸，分子量为80.37 KDa，pI为9.23，且该酶二级结构中α-螺旋少于β-折叠。研究通过构建大肠杆菌表达载体获得重组凝乳酶，其凝乳活性为15870±1.17 SU/g，该酶具有很强的疏水性，二级结构中α-螺旋较少，结构相对不稳定，同源蛋白序列分析结果表明该酶与来自甲醇芽孢杆菌的hypothetical protein具有同源性且氨基酸序列完全一致，经过SWISS-MODEL同源建模的方法成功确定了甲醇芽孢杆菌凝乳酶在PDB蛋白数据库中的模板蛋白2ra1.1.A，并分析获得了该蛋白的原子构成、氢键分布和分子表面的电势等情况。以甲醇芽孢杆菌凝乳酶、混合酶制剂制作的马苏里拉干酪为实验组，以商品酶干酪为对照组，测定不同组别干酪成熟期间的质构、风味的变化，其中甲醇芽孢杆菌凝乳酶干酪与商品酶干酪差异较大，感官评定得分偏低，混合酶干酪与对照组质构与感官得分一致，因此甲醇芽孢杆菌凝乳酶可以作为商品酶的部分代替品应用在干酪的生产中。本研究成果究对于深入开发我国传统食品资源，促进具有自主知识产权凝乳酶的研发，加快我国干酪产业的发展具有重要的理论和实际意义。