干酪加工专用微小毛霉凝乳酶的分子改造及其产业化

对真菌来源的凝乳酶实施分子改造，提高其底物专一性，降低其热稳定性，对于干酪生产具有重要意义。本课题拟以微小毛霉凝乳酶为研究对象，突变特定氨基酸位点的碱基，在保证其凝乳活力不降低的前提下，降低其非特异性水解活力和热稳定性。即运用蛋白质模拟技术，首先构建凝乳酶底物κ-酪蛋白核心结构域的三维模型，将其与微小毛霉凝乳酶分子对接，获得二者氨基酸相互作用的详细信息。结合能量分析与空间结构分析，精确锁定微小毛霉凝乳酶的最佳氨基酸改造位点及取代氨基酸，利用分子生物学技术完成微小毛霉凝乳酶基因的定点突变后转化毕赤酵母菌。最后利用发酵罐培养含有微小毛霉凝乳酶基因的毕赤酵母菌，制备纯化的微小毛霉凝乳酶产品，利用干酪中试生产线检验改造后微小毛霉凝乳酶的生产性能。本研究可缓解我国干酪生产中高品质凝乳酶依赖进口，成本较高的现状，对我国乳业产业升级具有重大意义。

本研究以微小毛霉凝乳酶为研究对象，利用计算机模拟技术构建了凝乳酶底物κ-酪蛋白核心结构域的三维模型，与微小毛霉凝乳酶分子对接，获得二者氨基酸相互作用的详细信息。结合能量分析与空间结构分析，确定改造方案为218位点苏氨酸分别突变为丝氨酸及丙氨酸（T218S、T218A）；287位点亮氨酸突变为甘氨酸（L287G）；利用分子生物学技术完成了凝乳酶基因的定点突变后转化工程菌，以凝乳活力，C/P比值及热稳定性为筛选指标，确定了T218S为微小毛霉凝乳酶基因最佳突变体；转化宿主菌毕赤酵母后，利用摇瓶实验获得了凝乳酶表达的最佳培养条件；发酵上清液经乙醇沉淀、SephadexG-75分子筛层析，DEAE-52离子交换层析法得到纯化的凝乳酶样品；经比较改造前后最适温度等酶学特性后发现，改造凝乳酶与出发菌株凝乳酶性质基本一致；改造凝乳酶只有最适温度有所改变，但更适合干酪的生产；最终，研究了发酵罐高密度培养宿主菌，及凝乳酶制备工艺并对比了两种凝乳酶制备干酪的常规化学成分、质构特性及感官指标，结果表明改造后凝乳酶制备的干酪各项指标较改造前有较大改善。