羊绒细度差异表达基因NFKBIA的分子调控机制研究

Cashmere fineness is the important index to measure the quality of cashmere. Molecilar regulatory of N-conding RNA regulat target gene expression is a research hotspot.The preliminary study shows that the presence of significant expression of MicroRNAs and LncRNAs in the fine and coarse cashmere goat skin tissue, may play an important role in the regulation of cashmere fineness of excellent gene expression. This project intends the basis is expression difference MiR-194 and XLOC-011319 to the common target gene NFKBIA between cashmere goat breeds. Build expression cloning vector of precursor、antisense and target. In cells, use dual luciferase report、Q-PCR、FISH、Western-Blot and MRM methods to determine the express of mRNA and protein of target gene by regulated MicroRNAs and LncRNAs. Elucidate the joint function of miR-194 and XLOC-011319 to target gene NFKBIA, and provides new clues to the molecular mechanisms controlling the cashmere fineness.

羊绒细度是衡量羊绒品质的重要指标。非编码RNA调控羊绒细度优异基因表达的分子机制备受关注。申请人前期研究表明，在羊绒细型和粗型绒山羊皮肤组织中存在差显表达MicroRNAs和LncRNAs，可能对羊绒细度优异基因表达具有重要调控作用。本项目拟以前期实验所得绒山羊品种间和品种内差显高表达的MiR-194和XLOC-011319及共同靶基因NFKBIA为依据，通过构建前体、反义和靶标表达克隆载体，在细胞水平应用双荧光素酶报告法、Q-PCR、荧光原位杂交、W-Blot和MRM方法检测MicroRNAs和LncRNAs调节靶基因的mRNA和蛋白表达水平。阐明MiR-194和XLOC-011319共同调节靶基因NFKBIA表达的作用，揭示羊绒细度调控的分子新机制。

羊绒细度是衡量羊绒品质的重要指标。辽宁绒山羊是重要的改良优秀父本，但是羊绒细度均值在16.0-18.5μm，为粗型。若要达到超细型羊绒，急需降到14.5μm以下，故迫切需要筛选出调控羊绒细度的功能基因。而非编码RNA调控羊绒细度优异基因表达的分子机制备受关注，期望通过高通量测序获得生信大数据，筛选出羊绒细度相关的重要基因。.申请者通过粗型和细型品种间绒山羊皮肤组织及品种内粗型和细型个体皮肤组织全转录组研究表明：在羊绒细型和粗型绒山羊皮肤组织中存在差显高表达mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA及4个羊绒细度差显高表达基因NFKBIA，KRT26、TCHH和COL1A1，可能对羊绒细度具有重要调控作用。通过全转录组研究，筛选到羊绒细度关键功能基因是NFKBIA，KRT26和TCHH，分别构建了3个基因的ceRNA调控网络及非编码RNA的表达量，阐明LOC108638466-mir-93-NFKBIA和 ciRNA452-mir-2330-NFKBIA调控通路，提示NFKBIA，KRT26和TCHH基因可能对羊绒细度发挥正调控作用。.通过RNA甲基化研究，获到19个存在m6A甲基化修饰位点的差异表达基因，其中COL1A1基因在粗型和细型皮肤中差显高表达，通过Q-PCR、WB和IF对COL1A1在皮肤组织中进行定量，定性和定位表达验证，显示 COL1A1在粗型辽宁绒山羊皮肤中高表达，表明COL1A1基因可能对羊绒细度发挥负调控作用。.通过单细胞转录组学研究，发现了构成辽宁绒山羊皮肤组织的13类已知和3类未知细胞，以及每类细胞中差异表达的基因。通过Q-PCR、WB和IF证明了粗型和细型皮肤SDPCs特异性标记基因ACTA2（α-SMA）和CXCL8（IL-8）在皮肤SDP中的定量、定性和定位表达。.通过基因鉴定研究，验证了NFKBIA基因的13个SNP位点，发现G1547A位点的GG基因型具有最细羊绒细度为14.9μm，可能作为羊绒细度的一个重要分子标记。.综上所述，通过全转录组学筛选和分析粗型和细型绒山羊皮肤组织中调控羊绒细度的基因及调控网络，应用Q-PCR、WB和IF验证羊绒细度功能基因的定量、定性和定位表达，为羊绒细度分子调控提供新的机制和基础理论支撑数据。