γ分泌酶抑制剂高通量筛选模型的建立和小分子抑制剂的发现

小分子抑制剂具有直接快速抑制细胞内靶点蛋白的功能,可为药物发现和疾病作用机理的研究提供分子探针工具。膜蛋白γ分泌酶因其酶底物APP和NOTCH蛋白分别与老年痴呆症和白血病直接相关，故被认为是老年痴呆症和白血病两种重大疾病的新型药物靶点蛋白。γ分泌酶的高级结构未知，其新型抑制剂的获得主要通过生物活性筛选。本项目拟构建新型的基于细胞的γ分泌酶不同底物（APP、NOTCH1和NOTCH2）的高通量的活性检测方法，并应用此方法从天然化合物库等中筛选得到特异抑制γ分泌酶不同底物剪切的小分子抑制剂。发现得到的针对不同底物剪切的γ分泌酶特异抑制剂，可进行二、三维结构与活性的构效关系研究，提炼和发现新型的分子骨架和药效基团，为γ分泌酶的未知催化机理和高级结构提供研究工具，同时为老年痴呆症和白血病的机理和治疗提供所需的分子探针工具和药物先导化合物。

老年痴呆症(又称阿尔茨海默症)是一类常见的进行性发展的致死性神经退行性疾病。膜蛋白复合体γ分泌酶被认为是老年痴呆症的重要靶点蛋白。γ分泌酶的精细高级结构未知,其新型抑制剂的获得主要通过生物活性筛选。因此,我们构建了基于APP和NOTCH底物的细胞和体外筛选模型。我们通过使用基于细胞和分子水平的γ分泌酶活性试验，完成对417天然产物的筛选。.我们发现一种FDA（美国食品和药物管理局）批准药物的成分DHEC可以在HEK293和来源于老年痴呆症患者的成纤维细胞上抑制γ分泌酶的活性同时减少细胞中A的生成。进一步的体外实验证明此化合物可以抑制体外γ分泌酶的活力。同时表面等离子体共振实验（Surface Plasmon Resonance assay）表明其可以直接结合到γ分泌酶上，结合γ分泌酶的平衡解离常数Kd为25.7 nM。此外，化合物DHEC可以特异的抑制APP底物的剪切而不抑制NOTCH底物的剪切，提示此化合物具有一定的底物特异性。结构活性关系研究发现DHEC的抑制效果主要依赖于一个由Leu-Val-Phe组成的环状多肽。这部分研究结果已总结撰写完毕，目前正在投稿之中。.同时，本项目研究过程中我们还发现了一种来源于银杏的天然产物可以抑制细胞里Abeta的产生，但在体外却不抑制γ分泌酶纯酶的活力，提示其在细胞内可能通过新型作用机制调控γ分泌酶的活力。其具体的细胞作用机制正在研究之中。.这项研究不仅提供新的γ分泌酶调控物，也利用“老药新用”策略为老年痴呆症的治疗和预防提供了现有药物，具有一定的实用和临床价值。.此外，利用本项目提供的研究方法和获得的化合物，我们对其他药物靶点进行了药物先导物的发现，发现了H2S气体信号通路的特异抑制剂，这一结果以通讯作者身份于2013年发表在Chemical Communications上；同时也发现了帕金森疾病靶点多巴脱羧酶的抑制剂，这一结果以通讯作者身份发表在2014年的ACS Chemical Biology上（封面文章）。