iPS细胞在组织工程心肌构建中的应用基础研究

Because of limited source and insufficient number of the primary cardiomyocytes, the tissue-engineered heart using the primary cardiomyocytes as seed cells was failure to be applied to clinic. The IPS cells induced from adult fibroblast were regarded as proper seed cells for their pluripotent without ethics dispute and immunity rejection reaction. However, the differentiating efficiency from iPS cell is low. We previously have built up a good platform of cardiac differentiation and cardiac tissue engineering. In this study, we establish a new iPS cell line containing a cardiac differentiation report gene from the aMHC-eGFP transgenic mice, to monitor the cardiac differentiation from iPS cell. By using a novel 3D co-culture mode, we try to find the mechaniasm of the integrin signaling regulating this differentiation to improve the differentiation rate of IPS efficiently. An acellular matrix obtained from adult heart was used as a scaffold. We use the iPS cell-derived cardiomyocytes as seed cells to construct tissue-engineered myocardium in a biological reactor by cyclical perfusion culture and neovascularization techniques. The aim of this study is to investigate the use of iPS cell in cardiac tissue engineering. We try to get the knowledeg of the mechanism in cardiac regeneration and provide the new idea about the design of an artificial heart.

心肌细胞由于增殖能力差且来源受限，不适宜作为组织工程心肌构建的种子细胞。如何寻求合适的种子细胞是目前迫切需要解决的问题。iPS细胞源于体细胞重编程，具有多向分化潜能且避免了伦理及免疫排斥问题，是比较理想的种子细胞来源。但iPS细胞分化效率低下，不足以制备大批量的种子细胞。我们前期研究中建立了心肌分化与组织工程心肌构建的优势平台。本研究拟利用aMHC-eGFP转基因小鼠建立携带心肌分化报告基因的iPS细胞系，实时追踪iPS细胞的心肌分化过程；在3D共培养诱导体系下，探索Integrin信号途径调控iPS细胞心肌分化的机制，从而高效地诱导iPS细胞向心肌细胞分化。通过脱细胞基质支架种植iPS细胞来源的心肌细胞，联合组织化培养进行组织工程心肌构建的初步研究，评价iPS细胞应用价值。本研究旨在探讨iPS细胞在组织工程心肌构建中的作用及其心肌再生机理，为心肌梗死患者的心肌修复治疗提供新的理论依据。

诱导多能干细胞（iPSC）源自于体细胞重编程，具有多向分化潜能且避免了伦理及免疫排斥问题，是当前构建组织工程心肌比较理想的种子细胞来源。但因iPSC向心肌细胞分化的效率低下且分化过程参与机制不清，目前尚难以人工制备大批量的种子心肌细胞。我们利用3D共培养诱导体系、单细胞层平铺培养体系等多种分化培养方法，探索了参与iPSC心肌分化的多种信号途径及其作用机制。团队还尝试利用心脏脱细胞基质支架种植iPSC来源的心肌细胞，并联合组织化培养进行了组织工程心肌构建的初步研究。研究发现：将iPSC与新生小鼠心肌细胞置于3D共培养体系分层隔离培养，可诱导细胞内FAK/JAK信号活化，增强iPS-CM细胞增殖分裂能力，从而促进其心肌细胞分化。另外，细胞外基质Collagen与细胞表面β1 integrin受体作用对于形成正常EB体结构至关重要，阻断这一信号通路将降低iPSC的心肌分化效率；进一步研究发现，添加维生素C可以促进拟胚体细胞外基质中胶原成份的合成，进而通过Collagen1A1/ β1 integrin作用活化细胞内MEK-ERK信号，从而提高iPSC心肌分化率。此外，研究还揭示肾上腺激素可通过α1亚型肾上腺素受体作用促进心脏祖细胞（CPCs）增殖，从而提高iPS-CM分化率。证明循环系统输送的外源性激素在心脏发育分化过程中也发挥重要作用。脱细胞基质支架接种iPS-CM实验结果发现：iPS分化出的心肌细胞无法在脱心脏脱细胞基质支架定植，无法形成具有收缩功能的心脏肌肉组织。说明单纯使用iPS源心肌细胞灌流培养方法不适用于构建组织工程心肌。最后，研究还发现细胞外基质的三维立体空间结构可独立影响iPSC分化过程中胞内wnt/β-catenin信号活性，有利于其向心肌方向分化。因此，在组织工程心肌构建工作中细胞外基质骨架的设计与构建也需要予以统筹考虑。总之，本课题从多个角度研究iPSC向心肌细胞分化的信号机制，并且进行了iPS源心肌细胞构建组织工程心肌初步尝试，通过人工干预这些机制可以大幅提高iPSC向心肌细胞的分化效率，这为心肌梗死患者的心肌修复治疗以及构建人工心脏提供了新的理论与实验依据。