基于iPS细胞体外构建工程化淋巴组织的实验研究

Recently, rapid progress has been made in the filed of lymphoid tissue reconstruction in vitro. Reconstructed lymphoid tissue has important application prospect in the immune system related diseases, vaccines and adjuvants evaluation of model in vitro. It has been reported that iPS cells can differentiate to lymphocytes in vitro, and the Notch signaling pathway plays an important role in the development of lymphocyte. The project will use iPS derived lymphocytes as seeding cells, collagen gel and/or chitosan as cell scarffold, to reconstruct lymphoid tissue in vitro, and evaluate its structure and function by histology, immunohistochemistry and molecular biology methods. Meanwhile, further study effect of the Notch signaling pathway on the process of iPS differenting to lymphocyte and its molecular mechanisms, and compare effect of two-dimensional and three-dimensional culture environment on the Notch signaling activation. This study is expected to lay the foundation for reconstructed lymphoid tissue by iPS and have potential application in the treatment of immunodeficiency disease and evaluation in vitro.

近年来，淋巴组织体外三维再造研究进展迅速。再造淋巴组织在免疫系统相关疾病治疗、疫苗与佐剂体外评价模型等方面具有重要应用前景。已有研究报道表明，iPS细胞在体外可分化为淋巴细胞，而Notch信号通路活化则在淋巴细胞发育过程中发挥重要作用。本项目拟首先开展iPS向淋巴细胞诱导分化的研究，再以iPS诱导分化来源的淋巴细胞作为种子细胞、胶原凝胶和/或壳聚糖大孔材料为支架，体外构建工程化淋巴组织，并通过组织学、免疫组织化学及分子生物学方法，对再造工程化淋巴组织进行结构与功能检测。在上述研究基础上，进一步探索iPS向淋巴细胞诱导分化过程中Notch信号通路活化的规律及其分子机制，并比较二维和三维培养环境对Notch信号通路活化的影响。本研究有望为利用iPS体外构建淋巴组织奠定基础，在未来临床免疫缺陷性疾病治疗及相应体外评价模型方面具有潜在应用前景。

工程化淋巴组织/器官的三维再造研究近年来已取得明显进展，再造的工程化组织/器官，如淋巴组织样类器官、人造淋巴结、三维淋巴组织培养物以及组织工程化脾脏等为临床免疫缺陷性疾病治疗和体内外模型研究奠定了基础。然而，目前大部分用于淋巴组织三维再造研究的种子细胞多为终末分化的淋巴细胞，不仅种类繁多，还存在来源受限、数量少等多种缺陷。干细胞技术的快速发展，尤其是诱导型多能干细胞（iPSC）的出现为解决这一问题提供了新的思路。由于免疫组织/器官在结构和功能上的特殊性，对体外三维再造工程化淋巴组织所需的支架材料也提出了更高的要求。本项目首先掌握了诱导型多能干细胞（iPSC）、造血干细胞（HSC）、OP9细胞、OP9-DL1细胞体外培养、扩增的关键技术，摸索并优化了干细胞向淋巴细胞（T淋巴细胞、B淋巴细胞等）分化的培养条件和体系，在此基础上，建立并完善干细胞向淋巴细胞分化的技术平台；其次，针对体外三维再造工程化淋巴组织的微环境，研制并筛选了一系列胶原基、壳聚糖基支架材料，对不同组成、孔径、力学性能的生物材料进行了比较研究和生物学评价，得到了一批生物相容性良好、可用于体外三维组织构建的支架材料；在种子细胞选择研究和支架材料筛选研究的基础上，将不同的种子细胞与不同的支架材料复合，体外成功构建了工程化淋巴组织，并运用大体观察、组织学、组织化学、免疫组织化学以及分子生物学等检测手段，对三维再造的淋巴组织的形态、结构和功能进行了评价，体外构建的工程化淋巴组织中细胞生长状态和活力良好、可表达相关的免疫细胞表面标志分子。此外，我们还研究并探讨了二维培养体系和三维培养体系对干细胞向淋巴细胞分化的不同作用及其对T、B淋巴细胞增殖、分化和成熟的作用和机制。本项目的研究结果将为淋巴组织/器官的组织工程研究奠定基础，对深入探讨干细胞来源淋巴细胞的增殖、分化和成熟的分子机制具有促进作用，进而推动未来临床免疫缺陷性疾病治疗研究。