Ihh在组织工程骨构建中作用和机制研究

目前成骨细胞发育的详细分子机理尚未阐明，探讨这方面的机制，对骨和有关疾病的防治具有十分重要的意义。本课题是在前期工作的基础上，以骨髓基质干细胞（MSCs）为模式，将具有示踪作用的pLNCX2-EGFP-Ihh重组逆转录病毒转导MSCs，诱导成骨，分别利用逆转录Realtime－PCR、Luciferase分析和Multiplex Western blot等对Ihh在骨发育中血管化（angiogenesis）作用与Wnt和 BMP的信号串话（crosstalking）机制开展深入研究，后采用组织工程技术，以藻酸盐/I型胶原为支架复合Ihh诱导的细胞修复中国青山羊胫骨缺损（20mm）模型，用X线、激光共聚焦荧光显微技术，组织化学和原位杂交等研究Ihh在体内局部的作用。研究Ihh信号转导在成骨中的作用机制,对探索Ihh在构建组织工程骨中的构建具有重要价值和应用前景。

摘要.背景：目前，早期血管化是骨组织工程修复骨缺损的基础，因而采用生长因子诱导骨髓基质干细胞向骨细胞及促进缺损部位血管化成为了研究热点。有研究证实Indian hedgehog信号通路在骨发育与血管发生中均发挥着重要的作用。.目的：探讨Ihh转导信号通路对C3H10T1/2与BMSC 细胞的调控作用及机制，检测植入Ihh+EGFP+BMSC/HA复合物对胫骨平台缺损的修复能力。.方法：体外培养Ihh+EGFP+C3H10T1/2与C3H10T1/2细胞，镜下和HE染色观察比较其形态变化，实时定量PCR和RT-PCR检测骨细胞及血管内皮细胞相关基因的表达水平，阿尔新蓝染色检测骨基质的表达情况。分别植入Ihh+EGFP+BMSC/HA、EGFP+BMSC/HA、BMSC/HA三组复合物，于2w、4w、8w、12w不同时间点处死动物，并行大体观察，CT及HE染色检测新生骨组织及血管的生成情况。.结果与结论：检测结果显示镜下Ihh+EGFP+C3H10T1/2细胞形态发生明显改变，可见类骨细胞。AKP、VEGF、Col2a1等骨和血管分化相关基因以不同速度上调表达；培养14d和21d后，细胞表达OC、ColⅩ、ColⅠ、Flk-1、CD31等一系列骨及血管分化的相关基因；细胞骨基质生成较丰富。这表明在C3H10T1/2细胞体外培养过程中，Ihh能有效地诱导其向骨细胞或血管内皮细胞分化。Ihh+EGFP+C3H10T1/2细胞中Wnt家族成员mRNA水平呈上调表达，Runx-2蛋白表达显著增强，说明Ihh可通过调控Wnts促进细胞向骨细胞分化。植入Ihh+EGFP+BMSC/HA复合物组，其胫骨缺损愈合情况明显优于其他组，即Ihh在构建组织工程骨中具有重要的作用。这为进一步探讨Ihh信号通路在骨发育及血管发生方面的调控机理奠定了基础，并运用到临床组织工程骨上，从而为解决骨组织工程早期血管化提供新的方案。