牛卵母细胞冷冻前后CD9表达量对精卵结合的影响

牛卵母细胞冷冻保存对于牛体外胚胎生产和克隆具有重要意义，本课题组前期研究发现在精卵结合中扮演重要角色的四跨膜蛋白CD9在冷冻保存后分布发生变化，进而影响了精卵结合。本研究拟采用免疫印迹技术对冷冻前后GVBD期和MII期牛卵母细胞CD9的分布进行定量分析；拟通过对新鲜卵母细胞进行单克隆抗体或RNAi处理降低CD9表达量，对冷冻后卵母细胞进行外源CD9mRNA显微注射导入后增加CD9表达量，探讨CD9表达量对卵母细胞与精子的相互结合、融合能力的影响。本研究目标在于探明超低温冷冻前后的不同成熟时期牛卵母细胞CD9表达量的变化，通过相关性分析验证低温打击是否是冷冻保存过程中导致CD9分布及表达量变化的主要因素。本研究对受精生物学精卵结合理论研究具有重要意义，同时为提高牛卵母细胞冷冻后体外受精效果提供技术支撑，有利于繁殖生物技术的推广和应用。

牛卵母细胞保存对于牛体外胚胎生产和克隆具有重要意义。本研究旨在探明跨膜蛋白CD9在牛卵母细胞与精子的相互结合与融合中所起的作用，并探讨超低温冷冻前后的不同成熟时期牛卵母细胞CD9表达量的变化，以及这种变化对超低温冷冻牛卵母细胞与精子结合的影响。采用免疫印迹技术对冷冻前后MII期牛卵母细胞CD9的分布进行分析；通过qRT-PCR和western blot检测CD9的表达；采用免疫荧光染色对冷冻前后牛成熟卵母细胞全基因组甲基化进行测定；并通过对卵母细胞进行单克隆抗体处理降低CD9表达量来探讨CD9表达对卵母细胞与精子的相互结合与融合的影响。结果表明：CD9在新鲜牛成熟卵母细胞膜上呈均匀分布，卵母细胞冷冻后CD9在牛卵母细胞膜上仍有分布，但分布没有新鲜组那么均匀。卵母细胞冷冻后，CD9 mRNA和CD9蛋白表达量显著下降，而全基因组甲基化水平显著上升。用CD9单克隆抗体对无透明带的卵母细胞处理45min，然后进行受精，8小时后发现，每个卵母细胞结合的精子数仅为1.4±0.1个，而对照组每个卵母细胞结合的精子数则高达6.7±0.2个（P<0.01）。当受精达到18小时时发现处理组卵母细胞的精子穿入率仅为23.7％（31/131），而对照组（未经CD9抗体处理）卵母细胞的精子穿入率则显著较高，为78.5％（117/149，P<0.01）。这些数据表明CD9参与精卵的结合与融合，并且超低温冷冻保存引起的CD9表达量下降和全基因组甲基化上升是导致精卵结合与融合能力下降的重要原因。本研究结果进一步丰富了受精生物学精卵结合理论，同时为提高牛卵母细胞冷冻后体外受精效果提供技术支撑，有利于现代繁殖生物技术的推广和应用。