苹果GPP和MIPP基因的功能及其与抗坏血酸合成调控的关系

抗坏血酸（AsA）是植物生长发育必不可少的抗氧化剂和酶辅因子，它在植物中的合成和代谢途径已得到证实，但目前在序列特征和蛋白质结构上相似的GPP和MIPP基因的功能及其关系，以及两者和其它合成酶基因在AsA合成中的调控作用尚不清楚。本项目拟对从苹果中克隆的GPP和MIPP基因分别进行原核表达，纯化异源蛋白，分析其性质及其对底物的选择性和亲和性；分别将其转入番茄，分析两个基因的过量表达对植株表型、AsA水平及抗性的影响，进而探明GPP和MIPP的生物功能及其二者的关系。同时系统分析苹果果实和叶片发育过程中及干旱胁迫下GPP和MIPP及其它参与 AsA合成相关基因的表达量与AsA积累的关系，探索活体中GPP或MIPP对AsA合成是否具有调控功能。其目的是探明苹果GPP和MIPP基因的功能及其AsA合成的关键调控基因，为提高植物AsA含量及获得与AsA水平相关标记奠定基础。

从苹果果实中克隆了GPP和MIPP全长cDNA，在E.coli BL21中表达获得了异源表达蛋白，纯化的蛋白能分别特异的催化Gal-1-P和MI-1-P。以纯化的His-GPP和His-IMP融合蛋白为抗原，制备了具有特异识别性的多克隆抗体。Western杂交结果表明，苹果不同组织中均可检测到33 KD GPP和39 KD IMP的表达，GPP与AsA含量相关性较高。苹果果实发育过程中AsA的积累主要取决于生物合成，且在整个发育过程中均有发生，而叶片中AsA的快速合成主要发生在幼叶向成熟叶的转变期。AsA合成代谢基因的表达与果实和叶片AsA含量相关性较高的有GPP、GGP、GalDH和DHAR。通过农杆菌介导法将苹果GPP导入番茄，过量表达后增加了AsA含量。此外，AsA-GSH循环参与了苹果对干旱胁迫的响应，干旱条件下AsA合成能力增加。研究结果基本探明了苹果果实中AsA形成和积累的机制，明确了GPP、GGP等AsA合成基因的表达水平调控着苹果果实及叶片AsA含量，系统了解了参与苹果AsA代谢相关蛋白质表达与果实AsA积累的关系，为进一步研究并改良苹果AsA提供了基因资源和理论基础。