调控番茄抗坏血酸氧化酶基因关键转录因子克隆与功能分析

抗坏血酸（AsA）是人体必须的抗氧化物质。植物AsA合成与代谢主要途径初现轮廓，关键酶基因基本明晰，然而其调控机制尚不明确。转录调控由于具强表达性和多位点协同效应而备受关注。本项目以番茄为材料，在本课题组抗坏血酸氧化酶基因（AO）和AO启动子结合蛋白基因(AOBP)工作基础上，从AsA代谢关键基因AO及其启动子出发，基于转录因子的识别、结合和转录过程，利用酵母单杂交和AO表达差异筛选转录因子，结合AO基因上游调控元件预测结合蛋白，从而获得候选的调控AO转录因子，通过一对一酵母单杂交或表达谱验证，确认调控AO关键转录因子。通过超量表达和RNAi抑制，阐明转录因子对AO调控机制，研究AO转录因子生物学功能，通过gfp核定位和转录激活分析研究AO转录因子特征。项目试图以发掘调控AO转录因子为切入点，为植物抗坏血酸合成与代谢调控提供依据，并创制维生素C含量提高的番茄新种质，具有重要理论和实际意义。

L-抗坏血酸(AsA, vitamin C)，是植物和动物中重要生物活性的抗氧化剂。人类不能自主合成AsA，只能从膳食中获得。番茄(Solanum lycopersicum)是一种研究果实品质的模式植物，也是一种重要的蔬菜作物。番茄抗坏血酸的合成D-甘露糖/L-半乳糖途径中的相关基因的功能已比较清楚，但调控相关合成酶的转录因子尚还没有鉴定。本项目鉴定了一个与番茄抗坏血酸氧化酶基因AO启动子结合的Dof转录因子（SlDof22），转基因功能验证结合基因芯片技术阐述了转录因子SlDof22在番茄抗坏血酸含量积累中的作用机制。SlDof22蛋白可以和SlAO基因启动子中的CTTT串联重复元件特异性结合。SlDof22基因为组成型表达，在番茄各个组织中的表达量均较高。干涉SlDof22基因显著下调转基因植株叶片和果实中SlDof22基因的表达量，提高番茄叶片和果实AsA含量。在叶片和果实中AsA含量比对照分别提高33%和64%左右，分别达到72.2 mg/100 g FW和43.3 mg/100 g FW。转基因植株对200mM NaCl胁迫表现敏感。抗氧化和SOS途径相关基因表达水平分析表明SlDof22可能参与调控SlSOS1基因的表达；酵母单杂交结果证明SlDof22可以和SlSOS1基因启动子结合调控其表达。基因芯片分析结果表明，干涉SlDof22基因转基因植株破色期果实中显著影响与光合有关和糖类代谢有关的代谢途径，同时也影响了与次级代谢、胁迫和激素相关基因的表达。同时通过番茄抗坏血酸合成酶基因GMP启动子为靶位点，得到与之互作的HD-Zip I家族的转录因子SlHZ24。SlHZ24结合SlGMP3启动子上的调控元件。在SlHZ24的超量株系中，SlGMP3的表达水平显著提升，相应地，AsA含量升高；相反，在RNAi干涉株系中SlGMP3下调表达，AsA水平降低。说明了SlHZ24正调控ASA的积累。此外，SlHZ24不仅限于调控SlGMP3，它还可调控AsA代谢途径中的其它基因实现多点调控，如调控SlGMP4、SlGME2、SlGGP和SlcAPX等表达水平。EMSA也实验证明SlHZ24可结合SlGME2和SlGGP的启动子。此外，还发现超量表达SlHZ24转基因株系对氧化逆境的抗性提高。转录因子的发掘有助于提高对抗坏血酸合成积累调控的分子机制的认识。