辣椒CaGalUR2基因调控抗坏血酸合成分子机制研究

Pepper is rich in nutrients and the content of ascorbic acid (AsA) in its fruit ranks first in the vegetables. The GalUR genes are key genes in the galacturonic acid pathway which is one of the AsA biosynthetic pathways. It plays a significant role in controlling the content of AsA in fruit. But the molecular mechanism of GalUR genes in pepper fruit is still unknown. Early in the project，we identified the key gene, CaGalUR2, by feeding precursor and gene expression analysis. In this study, on the basis of the molecular evolutionary principles, the evolutionary pattern and differentiation pattern of GalUR genes in pepper will be revealed. Next, we will investigate the biological functions by phenotypic and AsA content analysis in overexpress and repress CaGalUR2 transgenatic plants respectively. Then, the interaction proteins and the upstream regulatory genes of CaGalUR2 will be obtained by RNA-seq, yeast two-hybrid and yeast one-hybrid, verified by BiFC, Co-IP, EMSA and so on. At last, we will clarify the molecular mechanism of CaGalUR2 involved in regulation of AsA biosynthesis in pepper. Our study will provide a basis for understanding the molecular mechanism of AsA biosynthesis in pepper and new gene sources and breeding objective for high-content Vitamin C vegetables.

辣椒富含营养物质，其果实中维生素C（抗坏血酸；Ascorbic acid；AsA）含量在蔬菜中居首位。半乳糖醛酸途径是AsA生物合成途径之一，其关键基因GalUR在果实的AsA合成中起重要调控作用。但GalUR基因在辣椒果实中参与AsA合成的调控机制尚未明确。项目前期，通过前体饲喂试验、表达数据分析等，鉴定出关键基因CaGalUR2。在此基础上，拟综合分子进化规律揭示辣椒GalUR基因的演化过程和分化模式；获得CaGalUR2过量及抑制表达的转基因植株，通过表型及AsA含量分析，明确该基因功能；利用转基因植株转录组数据、酵母双杂交及单杂交鉴定互作蛋白及上游调控基因，并应用BiFC、Co-IP、EMSA等技术验证，进而解析CaGalUR2在辣椒果实中参与AsA合成的功能及调控网络。这些研究将有助于解析辣椒果实中AsA生物合成机理，并为培育高AsA含量的辣椒等蔬菜作物提供基因资源及育种方向。

辣椒（Capsicum annuum），属茄科（Solanaceae）茄亚族（Solaninae Dunal）辣椒属，一年生或多年生植物，是重要的药食同源蔬菜，经济价值和社会效益极高。辣椒富含营养物质，其果实中的维生素C（抗坏血酸，L-Ascorbic acid，AsA）含量在蔬菜中排名首位。AsA是一种多功能代谢物质，可以直接或间接清理体内产生的过剩活性氧（ROS），维持人类及动植物生命活动并保证其健康。GalUR是AsA生物合成的半乳糖醛酸途径中的关键酶，该蛋白高度同源于NAD(P)H-依赖性醛-酮还原酶（aldo-keto reductases；AKRs）。本研究对AKRs基因的保留、核苷酸距离、蛋白质结构和选择压力进行分析，结果表明：A组AKR基因是GalUR候选基因，且A组比B组更保守；AKR基因的功能最早可以追溯到藻类；在水生植物向陆地植物进化的过程中，AKRs基因的编码区开始分化；由于功能需求，基础被子植物中的AKR基因家族，特别是GalUR基因所在的A组，与苔藓植物相比，有明显的数量扩增；两组AKR基因在被子植物中发生了不同程度的损失和保留，基因数量表现出物种特异性，推测AKR家族的基因功能发生了明显的分化。以上结果为研究GalUR基因功能提供了理论依据。本研究进一步在辣椒‘HJ-N05’中克隆获得GalUR家族关键基因CaGalUR2，全长930 bp，编码309个氨基酸，亚细胞分析结果表明其定位在细胞质中。CaGalUR2在辣椒的果实成熟过程中的表达趋势与AsA含量具有相关性，在非生物胁迫处理下也有明显的上调趋势。在拟南芥中的超表达和沉默表达证实CaGalUR2对AsA的含量提升有一定的作用，并且与植物抗逆性相关。共表达网络和体外互作研究发现CaGalUR2和醛脱氢酶，半乳糖激酶具有互作作用，但并没有与AsA生物合成途径中的下游蛋白GalLDH形成互作关系。推测CaGalUR2对AsA的生物合成起到了补充作用，可能与半乳糖激酶或醛脱氢酶互作形成AsA的上游底物从而促进AsA的合成。本研究初步解析辣椒CaGalUR2基因的功能，为揭示CaGalUR2在辣椒果实中参与AsA合成的功能及调控网络提供了理论基础，为辣椒等蔬菜作物的品质性状遗传改良和种质创新提供重要基因资源。