苹果属cystatins基因在干旱胁迫应答中的功能及分子调控机制研究

Plant cystatins play an important role in enhancing tolerance of both biotic and abiotic stress, but the molecular mechanisms and regulatory pathway by which cystatins respond to stresses remains unclear. Our previous data demonstrated that the expression of apple cystatin genes is induced by drought and other abiotic stress. Meanwhile, ectopic expression of MpCYS2 and MpCYS4 from Malus prunifolia conferred drought tolerance in Arabidopsis. We also identified an interacting partner of MpCYS4 using Yeast Two-Hybrid screening, MpFER1. In this project, we will (1) verify the interaction between MpCYS4 and MpFER1 by BiFC and isolate the interacting partners of MpCYS2 in M. prunifolia by Yeast Two-Hybrid screening assay, (2) perform inhibition assay of cysteine protease activity by MpCYS2 and MpCYS4 fusion protein in vitro, examine their subcellular localization, and over-express or silence them in apple to investigate the functions of MpCYS2 and MpCYS4 under drought stress in apple. To investigate how MpCYS4 is involved in ABA signaling pathway and the regulatory network under drought stress, we will characterize the phenotypes and transcriptome of transgenic apples overexpressing or silencing MpCYS4 and MpFER1. The ultimate goal of this project is to reveal the function and regulatory mechanisms of cystatins (MpCYS2 and MpCYS4) during drought stress in Malus plants, and provide new theoretical basis for plant drought resistance mechanism and genetic breeding for stress resistance.

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatins)在提高作物对生物和非生物胁迫的抗性等方面具有重要作用，但其分子机制及调控途径尚不清楚。项目组前期研究发现，苹果基因组中cystatins基因的表达受干旱等多种非生物胁迫诱导，富平楸子MpCYS2和MpCYS4在拟南芥中过量表达能提高其抗旱性。酵母双杂筛选到一个与MpCYS4互作的蛋白—MpFER1。在此基础上，本项目拟通过BiFC等手段进一步验证MpCYS4和MpFER1 的相互作用并筛选与MpCYS2互作的蛋白；通过对MpCYS2和MpCYS4原核表达、亚细胞定位、转化苹果，进一步鉴定其在苹果干旱应答中的功能；利用MpCYS4和MpFER1干扰和过量表达的苹果转基因材料，分析干旱下MpCYS4对ABA信号的调控并通过转录组测序分析其调控通路。其目的是探明cystatins在干旱胁迫中的功能及分子调控机制，为植物抗旱机理和抗逆改良提供新的理论依据。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin）是生物体内能够抑制半胱氨酸蛋白水解酶活性的一类蛋白，但其抗逆的分子机制及调控途径尚不清楚，苹果cystatin家族基因的生物学功能方面的研究未见报道。本研究在系统鉴定了苹果基因组中所有cystatin基因的基础上，对苹果属植物‘富平楸子’（Malus prunifolia）MpCYS2、MpCYS4和MpCYS5基因的抗逆生物学功能进行了研究。结果表明：干旱胁迫下MpCYS2转基因植株抗性更强，MpCYS2影响干旱胁迫下转基因植株的生长和耐旱性可能是通过影响植株体内ROS的积累和根毛的发育来实现的。MpCYS4基因在拟南芥和苹果矮化砧木‘M26’中过量表达后，导致植株对ABA超敏感和其他一系列ABA相关的表型，如促进了ABA诱导的气孔关闭过程，改变了很多ABA和胁迫响应基因的表达，并且提高了植株对干旱胁迫的抗性。转录组分析表明，MpCYS4可能参与了ABA信号传递过程，通过促进干旱胁迫下气孔的关闭，调节ABA和干旱响应基因的表达，提高植株的抗旱性。MpCYS4基因也可以影响苹果叶片自然衰老以及胁迫诱导的衰老过程中叶片的光合能力和叶片蛋白的含量和组成。通过酵母双杂交试验，筛选到与MpCYS4互作的蛋白MpFER，MpFER的表达也受到干旱和外源ABA的诱导，MpFER基因导入拟南芥功能缺失突变体fer-4，可以恢复其对ABA超敏感的表型。因此，MpCYS4可能通过与MpFER互作参与苹果干旱胁迫应答过程。通过农杆菌介导的遗传转化成功获得了与拟南芥FER相似度最高的MdMRLK2过量表达及干扰表达的苹果转基因株系，并鉴定了MdMRLK2对干旱、盐胁迫以及腐烂病抗性的调控功能。MpCYS5在拟南芥中异源表达后，植株同时表现出了对盐胁迫和对衣霉素诱导的内质网胁迫的抗性。研究结果为植物抗旱机理提供了新的理论依据，为苹果抗逆改良奠定了基础。