黄瓜叶片胞间隙和细胞壁抗霜霉菌侵染相关蛋白的表达分析

霜霉病是黄瓜栽培中最严重的常发性、流行性病害。目前尚无对霜霉病完全免疫的品种，而化学防治导致农药残留和病原菌的抗药性等问题日益突出，加强对黄瓜霜霉病抗性分子机理研究，对于黄瓜无公害生产及抗病分子育种具有重要意义。本研究针对黄瓜霜霉病抗性分子机理研究的空白和薄弱领域，依据霜霉菌丝体在抗、感基因池叶片胞间隙、细胞壁生长和发育的显著差异，以胞间隙、细胞壁为研究区域，运用蛋白质组学技术系统研究抗霜霉菌侵染相关蛋白的差异表达规律；对抗霜霉菌侵染相关蛋白分子进行筛选；运用荧光定量PCR、Western-Blot分析其在转录和翻译水平上的差异表达；通过体外抑菌试验、组织显微观察和免疫组化试验相结合的手段，研究候选蛋白与抗霜霉菌侵染的关联性及作用。研究结果不仅能获得一些传统手段无法得到的候选蛋白，为黄瓜抗霜霉病分子改良提供重要的目标基因，而且可望从一个全新的角度理解抗性差异蛋白在霜霉病抗性中的作用和贡献。

霜霉病是黄瓜生产上最严重的病害，加强对黄瓜霜霉病抗性分子机理研究，对于黄瓜无公害生产及抗病分子育种具有重要意义。本项目利用蛋白质组学技术，系统研究了高抗种质 “PI088”和感病种质“CCMC”在接种霜霉菌后0、1、2、4d的叶片分泌蛋白质组的变化。比较不同接种时间点黄瓜抗/感种质的叶片胞间隙和细胞壁蛋白的双向电泳图谱，共有143个表达差异在1.5倍上的蛋白点，经MALDI-TOF/TOF MS分析，鉴定出130个蛋白点（鉴定率为90.9%），代表114种蛋白质，其中胞间隙和细胞壁蛋白组学中分别鉴定出40和74种蛋白质。对鉴定出来的130个蛋白点运用SecretomeP等程序进行预测和定位，有69个蛋白点（约53.1%）代表60种蛋白质定位在质外体空间，其中23种质外体蛋白具有信号肽，是由传统的分泌途径分泌，37种质外体蛋白是无前导肽蛋白，是由非传统的分泌途径分泌。. 分析比较了接种霜霉病菌后，抗/感病种质叶片质外体蛋白的表达差异，结果表明，抗病种质在接种霜霉菌后上调表达的蛋白数量（30/60）及表达量均显著高于感病种质（18/60）。对鉴定出的质外体蛋白根据其参与的生物学过程和分子功能进行分类，结果表明参与防卫相关的蛋白比例最高，占质外体蛋白的31%。. 随机挑选5种质外体蛋白，进行qPCR分析，结果表明，有4种质外体蛋白转录水平的表达模式与蛋白质组学的结果一致；而另1种蛋白的结果则相反，这说明蛋白质的表达水平不仅依赖于转录水平的调控，也与蛋白质翻译后调控有关。. 结合本项目的研究结果以及相关文献，利用qPCR对抗霜霉菌侵染相关蛋白分子进行了筛选，分析了另外7种蛋白(类甜味蛋白-TLP、过敏性诱导反应蛋白-CsHIR1，蛋白酶抑制剂-PI等 )在抗/感种质接种霜霉菌后0、6、12、24、48和96h转录水平上的表达变化，并对TLP、 PI和CsHIR1进行了原核表达和多克隆抗体的制备；分析了CsHIR1在翻译水平上的表达变化；为了更进一步研究CsHIR1蛋白和PI的功能，本项目优化了黄瓜再生体系，构建了CsHIR1和PI基因的植物表达载体，目前转基因的试验正在进行中。. 本研究结果可望从一个全新的角度理解抗性差异蛋白在霜霉病抗性中的作用和贡献。