定向进化改善米曲霉中性蛋白酶酶活和最适pH

Neutral protease in Aspergillus oryzae plays a crucial role at protein utilization, quality and flavor formation of soy sauce. Because neutral protease in A. oryzae can not effectively catalyze substrate in the acid environment, it is imperative to make protease efficiency work at lower pH. The npI gene was expressed heterogenously in Picha pastoris GS115 with α-signal peptide. Three dimensional structure of neutral protease I was constructed homologously with the SWISS-MODEL system. Then based on dimensional structure and the results of sequence alignment conservative amino acid sites which are all near the active center were chosen as mutant sites. The directed evolution of neutral protease from A. oryzae was carried out by quick change site-directed mutagenesis kit. The mutant genes were expressed in P. pastoris. The expressed mutant neutral protease was purified for compare their characters. One replacing target vectors were constructed vector, which includes two homologous arms of niaD and pyrG and mutant NPI gene, was transformed into mutant pyrG strain to get the mutant A. oryzae. It is useful and important to improve the protein utilization rate and flavor of soy sauce.

米曲霉中性蛋白酶对蛋白质的利用率、酱油的品质和风味形成起重要作用。偏酸性的发酵环境不利于米曲霉中性蛋白酶更大限度地发挥作用，有必要对其定向进化使其最适pH值下降。本项目拟将米曲霉的中性蛋白酶I基因在毕赤酵母GS115中进行异源表达。利用 SWISS-MODEL 分子模建服务系统同源模建米曲霉中性蛋白酶三维结构。再通过蛋白序列比对和三维结构结果，找出在活性中心附近且非常保守的氨基酸作为待突变位点。接着利用quick change突变试剂盒进行定点突变并将突变酶基因在毕赤酵母中表达，表达产物经纯化后对其酶学性质进行比较。然后将突变的酶基因克隆到含米曲霉 niaD 基因的同源臂和pyrG基因的整合型表达载体上，将其线性化后转化米曲霉pyrG突变株中，以获得能分泌NPI蛋白且在偏酸性条件下能保持高酶活的米曲霉菌株。本项目为提高酱油产品的原料利用率兼顾改进风味，国内酱油企业的国际竞争力增强提供保证。

米曲霉中性蛋白酶（neutral protease）是米曲霉在代谢过程中产生的酶系，主要用于酱油酿造生产中，以大豆或豆粕及小麦或面粉为主要原料，经过蛋白酶的分解作用，将蛋白质发酵水解成多种氨基酸，再结合其它的发酵产物，经过复杂的生物化学反应，形成具有特殊色泽、滋味和体态的调味液。毕赤酵母是已被广泛用于商业化生产外源蛋白，能对许多蛋白进行分泌表达，并产生各种不同的翻译后修饰过程，如多肽的折叠、糖基化、甲基化、酰化作用等。基于非理性设计的定向进化技术能够使研究者们在实验室内模拟自然进化机制，将自然界需上亿年才能完成的进化缩短至几个月，在短期内创造出新的酶类。利用定向进化技术对米曲霉中性蛋白酶进行改造，并从中筛选出理想的突变型，可有效改善蛋白酶在工业生产中的应用，最终为提高原料蛋白质利用率及改善酱油风味，降低生产成本奠定基础。.本项目利用毕赤酵母表达了NPI并进行酶学性质分析。PAS染色法及Endo H去糖基化处理法确定了NPI重组蛋白发生了糖基化现象。Nano LC MS/MS鉴定到其成熟肽段第41位氨基酸Asn为糖基化发生位点。利用易错PCR的方法构建了NPI毕赤酵母随机突变文库，从文库中筛得一株热稳定性提高的突变体酶，其最适反应温度由野生株的55 oC提高至60 oC，突变后的酶液56 oC半衰期由野生株的7.9 min延长至16.7 min，为野生株的2.1倍。.此外还从文库中筛选出一株最适酶活pH下降的突变菌株NPI-230，有三个突变位点，分别是Y122F、K246I、D382V。突变酶NPI-230最适作用pH为5.5，比突变前下降了2个单位，最高酶活提高了2.75倍。通过定点突变获得的NPI-Y186S的最适酶活pH为6.0，比突变前下降了1.5个单位，最高酶活提高了3.64倍。.经紫外诱变与5-FOA 抗性筛选得到一株尿嘧啶核苷依赖型米曲霉菌株AS11。测序发现点突变造成了 pyrG 的失活。以pyrG 为选择性标记，分别构建打靶载体pNP-NPI-6His、pNP-NPI-Y122FK246ID382V-6His和pNP-NPI-Y122FK246ID382VY186S-6His，并转化AS11原生质体，这三类转化子分别命名为：米曲霉D、E和F。AS11、D、E、F的酶活分别为3100.36、3978.41、4435.62和3540.27 U/g。