多肽毒素调制TRPV3通道的分子机制及药效学基础研究

TRPV3受体是一种对Ca2+通透的非选择性阳离子通道。该通道能被非伤害性温度和樟脑等化学物质激活。最近的研究表明该受体在皮肤炎症和瘙痒感觉中发挥重要作用，因而也被视为炎症和瘙痒治疗的一个新靶点。然而到目前为止还没有发现其选择性拮抗剂。我们的前期工作表明：HWTX-XI是一种具有钾通道和胰蛋白酶抑制活性的肽类毒素，其突变体L6Y-HWTX-XI能抑制2APB激活的TRPV3受体电流，但对TRPV1电流没有明显的拮抗作用。本项目拟首先应用激光共聚焦、膜片钳电生理技术研究该多肽调制TRPV3受体的分子机制，然后通过基因突变和蛋白质-蛋白质复合物对接技术对该多肽进一步改造以提高其对TRPV3受体作用的效能，最后建立皮肤炎和瘙痒动物模型探讨多肽对TRPV3受体的这种拮抗效应在皮肤疾病治疗上存在的潜在应用价值。从而为利用多肽毒素设计、合成和开发靶向TRPV3受体治疗相关疾病的药物提供科学依据。

TRPV3主要表达在皮肤角质细胞，是一种与瘙痒性皮肤炎和重症角化性皮肤病等皮肤疾病密切相关的温度敏感受体通道，目前尚未发现其特异性拮抗剂。项目申请中我们拟研究多肽L6Y-HWTX-XI拮抗TRPV3的分子机制。在进一步研究过程中，我们发现L6Y-HWTX-XI拮抗TRPV3是一个假阳性结果，项目做出重要调整。我们进行了以下三方面工作：（一）TRPV3电流幅值差异是通道的机械敏感性还是特异性拮抗剂作用？在实验中不同灌流管给予同浓度TRPV3激动剂，诱导的电流幅值有显著差异。这种现象在TRPV1和TRPM8受体上没有出现。我们用低渗细胞外液灌流能诱导出一个小的外向电流，暗示TRPV3可能具有一定的机械敏感性。但是，改变灌流管压力并没有引起明显的电流幅值变化。综合所有实验数据，我们推测不同灌流管给激动剂诱导TRPV3电流幅值存在差异可能有以下两种原因：①TRPV3受体表达在与触觉相关的皮肤角质细胞，其可能对某些特殊的机械刺激敏感，如剪切力、振动波等。②电流幅值下降的灌流管中可能存在特异性TPPV3拮抗剂。后续实验中我们将进行这两方面探索工作。目前有关TRPV3受体通道的特性了解甚少，且缺乏特异性TPPV3拮抗剂，这部分工作对我们研究TRPV3受体具有重要意义。（二）靶向TRPV3受体的多肽分子筛选。结合分子筛和高效液相色谱技术从蜘蛛毒液中寻找靶向TRPV3受体的多肽分子, 已完成初步的毒素组分分离纯化工作，目前正通过激光共聚焦和电生理技术检测各个混合组分对TRPV3受体的活性，并检测到三种组分对TRPV3和TRPV1受体有作用。后续工作我们将增加灵敏性更高的筛选方法，同时深入研究上述三种多肽组分作用于TRPV3和TRPV1受体的位点和分子机制，并通过分子改造获得高选择性的TRPV3激动剂。（三）心脏病药物方面的研究。我们在经费资助下开展了以下工作： ①士的宁及其结构类似物对Nav1.5通道的作用，为研究心脏药物与Nav1.5通道相互作用提供了重要的结构功能关系信息。这部分工作发表在Biochemical Pharmacology 杂志上。②新发现一种作用于钾通道的毒素多肽，与靶向Nav1.5通道的一组多肽序列高度保守，我们通过电生理手段、进化树分析对这类多肽进行了结构-功能关系分析，这部分结果发表在Toxicon杂志上。