蜘蛛多肽类毒素与Kv4钾通道相互作用的分子机制研究

电压门控Kv4钾通道广泛分布于神经元、心肌等可兴奋性组织中，在调节神经元放电频率和心肌兴奋收缩耦联等方面起重要作用，是一种重要的跨膜结构蛋白，也是治疗药物作用的重要靶标之一。敬钊缨毛蛛毒素-IX、-X、-XI是从我国特有强毒性蜘蛛-敬钊缨毛蛛的毒液中分离到的3种钾离子通道调制剂。本课题将深入研究这3种蜘蛛多肽毒素对多种已克隆钾离子通道亚型的不同选择性以及对哺乳动物Kv4钾离子通道的调制作用。运用钾通道定点突变等分子生物学技术和电生理技术，揭示Kv4钾通道亚型与敬钊缨毛蛛毒素发生相互作用的关键活性位点以及对毒素呈现不同亲和力的分子机制。运用多肽固相合成技术合成敬钊缨毛蛛毒素突变体，分析敬钊缨毛蛛毒素结合Kv4钾通道亚型的关键氨基酸残基，从而进一步提高目的毒素多肽对钾通道亚型的选择性和专一性。期望此课题的开展能为蜘蛛肽类毒素在神经生物学等方面的应用和药物先导分子的设计开发提供理论基础。

电压门控Kv4钾通道广泛分布于神经元、心肌等可兴奋性组织中，在调节神经元放电频率和心肌兴奋收缩耦联等方面起重要作用，是一种重要的跨膜结构蛋白，也是治疗药物作用的重要靶标之一。敬钊缨毛蛛（Chilobrachys jingzhao）是在我国海南省发现的具有很强毒性的大型蜘蛛。我们从敬钊缨毛蛛毒液中鉴定出了多种具有影响离子通道活性的多肽成分，并且选择了其中四种多肽成分（JZTX-V、-IX、-X、-XI）进行深入研究。. 敬钊毒素-V（JZTX-V）是从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化到的一种新型的肽类神经毒素。 JZTX-V是Kv4.3的一种高效抑制剂，JZTX-V可以使野生型Kv4.3的稳态激活曲线和稳态失活曲线向去极化方向发生显著性漂移，而且可以显著延缓Kv4.3的激活和失活时间常数，但对失活恢复时间常数没有显著性影响，因此推断JZTX-V是钾通道的一种门控调节型毒素。进一步将Kv4.3电压敏感区中S3b-S4上的氨基酸进行丙氨酸扫描，并研究JZTX-V与这些突变体的相互作用，发现第282位的缬氨酸和第286位的苯丙氨酸是JZTX-V与Kv4.3相互作用的关键残基。. JZTX-IX是从敬钊缨毛蛛毒液中分离鉴定到的一种新型神经毒素，由34个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键，C-端酰胺化。JZTX-IX为典型的ICK模体结构，分子中包含一段双链反平行β-折叠片。JZTX-IX能够与多种通道相互作用，包括电压门控钠通道、Kv2.1和Kv4（Kv4.2、Kv4.3）通道。JZTX-IX能够引起Kv4.2、Kv4.3通道的激活曲线往去极化方向漂移约10 mV。我们推测JZTX-IX是对通道亚型选择性比较低的通道调制剂，能够捕获电压敏感元件于静息状态。. JZTX-X由31个氨基酸残基组成,含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。利用膜片钳技术和电压钳技术鉴定了JZTX-X对电压门控离子通道的影响。JZTX-X能够抑制Kv4.2和Kv4.3通道，其IC50值分别是68 nM和210 nM。JZTX-X的抑制作用呈现时间依赖性并且这种抑制是可逆的。JZTX-X能够导致Kv4.2和Kv4.3通道电流-电压关系曲线往去极化方向漂移约10 mV，我们推测JZTX-X很有可能是通过与钾通道电压敏感元件相互作用从而抑制Kv4.2和Kv4.3通道。