新型低钙离子依赖碱性果胶酸裂解酶作用机制及其与碱适应性关系研究

Pectate lyases are believed to be the major virulence factor of pathogenesis in a broad range of plants and have important application in many biological industries. The pectate lyase PelA from Bacillus sp.N16-5 is the most alkaline and the first low Ca2+ dependent pectate lyase reported. Until now, the mechanism of substrate binding and catalysis for this low Ca2+ dependent pectate lyase has not been studied. The alkaline adaptation mechanism of pectate lyase is still unknown. And the relationship between alkaline adaptation and low Ca2+-dependence is also not clear. In this study, firstly we want to reveal the novel mechanism of substrate binding and catalysis of low Ca2+ dependent pectate lyase by crystal structure resolving and sequence and mutagenesis analysis of PelA and its complex with substrate and Ca2+.Secondly, we want to clarify the alkaline adaptation mechanism of pectate lyase by structure comparison, site mutagenesis and pKa analysis. Then combining the Ca2+ affinity in different pH and molecular evolution analysis and the alkaline adaptation mechanism of PelA，we want to reveal the relationship between alkaline adaptation and low Ca2+ dependence of pectate lyase. These researches will reveal a novel mechanism of substrate binding and catalysis of pectate lyase and alkaline adaptation mechanism of alkaline pectate lyase. And the research results will provide a theoretical guide for the molecular design of pectate lyase for the industrial application.

果胶酸裂解酶是许多植物发病机理的主要毒力因子且在许多绿色工业过程中具有重要应用价值。Bacillus sp.N16-5碱性果胶酸裂解酶PelA是首个低Ca2+依赖和具有最高碱适应性的果胶酸裂解酶,目前对于其低Ca2+依赖的底物结合与催化的作用机制及其碱适应分子机制还未有研究，这种低Ca2+依赖特性与其高碱适应性之间的关系也未可知。本课题拟通过对PelA及其与底物和Ca2+复合物结构的解析和比对及突变分析，揭示PelA不同于已报道果胶酸裂解酶的底物结合和催化模式；通过基于结构信息的比对、关键位点突变和pKa值分析及不同pH下Ca2+亲和性分析等，阐明PelA的Ca2+和底物结合域及催化活性中心等适应高碱性的分子和结构特征，揭示低Ca2+依赖性与其高碱适应性的关系。本研究可揭示果胶酸裂解酶新的底物结合与催化作用机制及其碱适应分子机制，并可为果胶酸裂解酶基于工业应用的分子改造提供理论指导。

碱性果胶酸裂解酶PelA是首个低Ca2+依赖和具有最高碱适应性的果胶酸裂解酶，其低Ca2+依赖的底物结合与催化的作用机制及其碱适应分子机制还未有研究。本课题通过对PelA及其与底物复合体结构的解析，结合结构与序列比对Ca2+亲和性分析，来揭示PelA的底物结合与催化模式及其高碱适应特征。研究结果发现PelA中部分保守的Ca2+结合位点发生了突变，使其只能结合1个Ca2+而不是其他果胶酸裂解酶的3或4个Ca2+，同时以His183取代了主要Ca2+底物识别功能，保证了PelA对底物的识别和结合，这是一种特殊的新的果胶酸裂解酶底物结合与催化机制。同时突变分析确定了其中的关键位点E119和H183位点不仅是PelA的Ca2+结合关键位点，同时也与其活性至关重要，而Thr121对PelA活性至关重要，而与Ca2+结合关联不明显。研究了PL1家族碱性果胶酸裂解酶基于其序列和结构的碱适应机制，初步揭示了高碱性的果胶酸裂解酶在其氨基酸组成和二级结构相较于弱碱性酶的特征，可为果胶酸裂解酶基于工业应用的分子改造提供理论指导。另外基于结构分析和不同pH下的Ca2+亲和性分析，结果显示PelA的Ca2+亲和性随着pH的升高而降低，在高碱性环境中有很多氢氧根离子会竞争与Ca2+配位，这很可能是其Ca2+亲和性在高pH下降低的原因。而PelA这种通过突变而发展出的低钙离子依赖特性，很可能就是其为了适应高碱性环境下低Ca2+含量的一种进化策略。另一方面，PelA的这种底物结合和催化位点的突变在其它的果胶酸裂解酶中还未发现，因此这种突变进化也有可能只是一个偶然事件，并不具有普遍性。此外在项目部分支持下，通过分子改造获得了稳定性和活性显著提高的PelA突变体酶，其应用性能也显著提高；同时表征了碱性果胶酶BacPelA，具有优于已文献报道果胶酶的生物脱胶性能，获得了其高表达菌株，具有很好的工业应用潜力。