基于土壤细菌宏基因组克隆新型群体感应信号降解酶基因

Quorum sensing (QS) is a regulatory system employed by bacteria to monitor their own population density by means of small signals and to coordinate the expression of specialized genes in respond to the environmental changes. Many phytopathogenic bacteria use the N-acyl homoserine lacton(AHL)-dependent QS system to regulate their virulence expression. Inactivation of the AHL molecules leads to a reduction of the bacterial virulence. Most of the characterized AHL degradase genes so far, are cloned from culturable bacterial strains, including a novel type of AHL lactonase gene aidH cloned from Ochrobacterum sp. by our research team. The present project, based on our previous quorum-quenching study, focuses on cloning and characterization of novel AHL degradase genes from soil metagenomic library, which is constructed by using genomic DNA from unculturable bacteria. A high throughput system for metagenomic library screening will be established based on a Escherichia coli host strain containing chromosome-integrated AHL biosynthetic gene pcoI. The cloned AHL degradase genes will be oeverexpressed in E. coli, and the action model of the recombiant proteins will be further characterized. Genes encoding novel metagenome-derived AHL degradases will be selected to test their quorum quenching functions in phytopathogenic bacteria and the potential utilization in biocontrol of plant bacterial diseases. Soil metagenomic DNA library construction and screening is a powerful tool to islolate new AHL qunenching enzymes, whose characterization may shed new light on the evolution track of QS and quorum quenching in bacteria.

群体感应（QS）是细菌的一种调控机制，即通过分泌和感应特定的信号分子来感知细菌自身群体密度，调控特定基因表达以适应环境变化。许多植物病原细菌利用以N-乙酰高丝氨酸内酯（AHL）为信号的QS系统调控致病性的表达。破坏AHL信号分子，即可造成细菌致病性丧失或减弱。已知的AHL信号降解酶基因多克隆自有降解AHL信号能力的可培养细菌，其中包括本课题组前期研究中克隆的源自苍白杆菌的新型AHL内酯酶基因aidH。在此基础上，本项目以土壤中不可培养细菌为主要DNA资源，构建细菌宏基因组文库，以染色体整合pcoI基因的大肠杆菌为宿主，建立高通量的AHL降解酶基因筛选体系，克隆获得新型AHL降解酶基因。对纯化的降解酶蛋白进行AHL降解机制的生化分析，并检测其对病原细菌致病力和生防细菌防病能力的影响。基于土壤宏基因组大量分离AHL降解酶基因资源，有望发现新的AHL降解机制及阐明AHL降解酶基因的系统发育关系。

群体感应(Quorum Sensing, QS)是细菌在进化过程中形成的依赖于群体密度的细菌间交流方式。多种植物病原细菌利用以 N-乙酰高丝氨酸内酯（AHL）为信号的QS系统调控致病性的表达。发掘AHL信号分子淬灭酶是防治依赖 QS 系统表达致病性的细菌引起的植物病害的可行性策略。.本研究通过构建宏基因组文库宿主菌和AHLs信号报告菌，建立了高通量筛选群体感应信号分子降解酶基因的体系。该体系具有灵敏度高、容易观察、操作简便、适合高通量筛选等优点，不仅可用于筛选群体感应信号降解酶基因，通过改造还可用于其他一些功能基因的筛选。结合宏基因组技术构建土壤细菌宏基因组文库，探究土壤中新型的群体感应信号分子降解酶基因。本研究分别从土壤细菌宏基因组文库和活菌文库中筛选得到aidL 和 aidE 两个降解酶基因。其中，aidL基因编码 848个氨基酸，序列相似性比对发现 AidL 氨基酸序列与 N 端水解酶家族有较高的相似性，且具有 N 端水解酶翻译后加工所需的特征保守序列 Gly-Ser-Asn，推测AidL 属于AHL-酰基转移酶。aidE 基因编码268个氨基酸。通过序列一致性比较发现，AidE 的氨基酸序列与 Acinetobacter gyllenbergii CIP110306 中 β-内酰胺酶(beta-lactamase)家族蛋白一致性高达95%，但与已知的 AHLs 降解酶序列一致性较低。HPLC分析AidE蛋白处理C6-HSL的反应产物，证明AidE为AHL内酯酶。AidE 的降解活性在37℃时较30℃更高，对不同类型的信号分子均具有较高降解活性。AidE为 Zn2+依赖型降解酶。分别表达 AidL和AidE 的菌株 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Z3-3 信号产生量减少，其致病力均有所降低。AidL和AidE在防治依赖 QS 系统表达其致病性的细菌引起的植物病害中具有应用潜力。