小RNA因子在调控生防假单胞菌2P24抗生素产生和根围定殖能力中的作用

生防菌Pseudomonas fluorescens 2P24的主要防病机制是产生抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚（2,4-DAPG），以及能在群体感应系统PcoR/PcoI的调控下大量定殖于植物根围。菌株2P24的抗生素产生及定殖能力同时受到上游双因子系统GacS/GacA的正调控。本项目利用分子遗传学手段分析小RNA（sRNA）因子在GacS/GacA信号传递途经中的功能。通过生物信息学方法自菌株2P24基因组序列中查找到多个sRNA基因，分别构建突变体并分析sRNA在生防性状表达中的作用。利用sRNA-lacZ转录融合报告，通过随机突变筛选调控sRNA的上游基因，并分析其调控特点。同时，以2,4-DAPG合成基因phlA和群体感应系统信号分子合成基因pcoI为靶基因，研究sRNA调控下游基因的分子机制。研究结果有利于解析假单胞菌生防性状表达的信号传递机制，并积累新的生防功能基因资源。

生防假单胞菌2P24产生抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol, 2,4-DAPG)、形成生物膜及在植物根部良好的定殖等是其主要的防病机制。这些生防能力的发挥受胞内多种调控系统的影响，其中小RNA因子在多种调控系统中承担重要作用。前期研究已通过遗传学方法鉴定了菌株2P24中小RNA分子基因rsmZ及调控蛋白编码基因rsmA，本研究利用生物信息学方法鉴定了菌株2P24中另两个小RNA因子基因rsmX和rsmY及一个调控蛋白编码基因rsmE基因。通过检测发现，小RNA因子RsmX、RsmY、RsmZ正调控抗生素的产生、生物膜形成及菌株的根围定殖能力，而调控蛋白RsmA、RsmE则负调控以上生防性状；进一步研究发现小RNA因子受双因子调控系统GacS/A的严格正调控，是Gac/Rsm途径的重要组成部分。蛋白激酶RetS定位于细胞膜上，与GacS蛋白物理互作，从而显著抑制小RNA的表达，通过Gac/Rsm途径负调控菌株2P24抗生素的产生。PsrA蛋白是细菌胞内调控rpoS基因、三型分泌系统及群体感应系统的重要因子。利用生物信息学方法在菌株2P24基因组中鉴定psrA基因，凝胶电泳迁移实验表明PsrA可直接与phlA基因启动子结合，抑制phlA基因的转录。除此之外，本研究还发现PsrA通过正调控α因子RpoS，而RpoS正调控抑制蛋白RsmA，从而在转录后水平抑制2,4-DAPG的产生。前期研究以群体感应系统信号合成基因pcoI的转录表达作为筛选指标，得到一株可明显降低pcoI基因转录水平的突变体PM112。鸟枪克隆表明突变体PM112中被Tn5破坏的是编码tRNA-U34 -C5羧甲基氨甲基修饰蛋白的基因gidA。gidA基因突变后pcoI基因的转录水平和信号N-乙酰高丝氨酸内酯产量显著降低，生物膜的形成也显著低于野生型。小麦根部定殖实验表明，gidA基因突变菌株在灭菌土和自然土中对小麦根尖和根围的定殖数量较野生型显著减少。同时，GidA通过独立于Gac/Rsm途径的方式正调控抗生素2,4-DAPG的产生。温室生测实验表明，gidA基因突变后显著降低了菌株2P24对番茄青枯病（Ralstonia solanacearum）的防治效果。