濒危孑遗植物翠柏的保护生物学研究

Calocedrus macrolepis Kurz is an endangered and relic plant with disjunct distribution in Southwest China and peripheral areas. It has high timber utilization and medicinal value, and belongs to national protection categories. Given that the massive death of seedlings in natural forest and exist of continuous cropping obstacles, we conjectured that it may have allelopathic effects. However, the related component, transmission mode, and mechanism of allelopathic effects are not clear. In this study, some control experiment will be designed, which simulate the potential allelopathic material to cypress seedlings. Then, the material source, composition and transmission of allelopathic effects will be detected using GC-MS method. Furthermore, molecular identification and soil metaproteomics technology will be used to analyze the types and functions of the rhizosphere microbial community, revealing the interaction effects between the root rhizosphere microbial community and seedling, which will elucidate the biological mechanism of seedlings death and continuous cropping obstacle in natural regeneration. Additionally, the genetic diversity and population structure of the natural populations of C. macrolepis will be analyzed by SSR. The genetic contribution, genetic variation, spatial distribution features of different populations will be analyzed. The impact and its correlation of allelopathy to genetic structure will be revealed. Then, the endangered mechanism will be clarified by reproductive and genetic evidences. Lastly, the populations for priority conservation will be identified and some conservation strategies will be proposed based on the integrated results, which will provide theoretical basis for other endangered plant studies of conservation genetics.

翠柏是一种濒危的孑遗植物，间断分布于中国西南地区及周边，具有很高的材用和药用价值，是国家二级保护植物。鉴于前期发现翠柏天然林中幼苗早期大量死亡和存在连作障碍，推断其受到化感作用影响，但具体化感物质成分、途径和作用机制不清楚。本研究拟通过控制实验模拟潜在化感物质对翠柏幼苗刺激，利用GC-MS法检测化感物质来源、组成和传播途径。进一步采用分子鉴定和土壤宏蛋白组学技术对根际微生物群落种类与功能进行分析，揭示化感作用下根际微生物群落与幼苗的互作效应，从而阐明翠柏幼苗早期死亡和连作障碍的生物学机制。同时采用微卫星分子标记技术对翠柏自然群体的遗传多样性进行研究，计算不同居群对整个物种遗传多样性的遗传贡献率，阐明遗传变异水平及其在空间上的分布特征。综合分析化感作用对种群遗传结构的影响，揭示翠柏濒危的生殖学及遗传学机制，确定优先保护种群，提出科学的保护和发展策略，也为其它濒危植物的保护生物学研究提供借鉴。

翠柏种子的发芽率在凋落物水提液、根茎叶水提液及茎叶挥发物的作用下均受到显著性抑制。而根际土水提液对种子发芽率没有显著影响。对于同一类型的浸提液来说，不同浓度化感浸提液处理间的种子发芽率无显著性差异，而不同浓度的浸提液存在显著差异。根茎叶水提液处理后种子发芽率在对照组、低浓度（2%）和中浓度（4%）浸提液处理下无显著性差异，但在高浓度（8%）化感浸提液处理下差异显著。说明翠柏自身的代谢物质对于种子萌发具有较强的化感作用。翠柏根茎叶不同器官化感物质组分含量存在差异。本实验选取的不同类型浸提液通过GC-MS总共鉴定出6种共有的物质，包括（Methyl stearate、13-Octadecenoic、methyl ester、Hexadecanoic acid、Cubedol），进一步结合这些物质的含量差异，表明这五种物质很可能是引起翠柏化感作用的主要物质。进一步对翠柏根际土微生物多样性展开分析。ASP和SNP菌根根际微生物群落生理代谢活性，碳代谢类群有明显差异。形成了各自独特的微生物类群。ASP菌根根际微生物以氨基酸类代谢群为优势类群，而SNP以糖类代谢群为优势类群。建立翠柏DNA提取方法及最佳SSR-PCR反应体系，用SSR分子标记方法研究翠柏天然群体种质资源的遗传多样性。物种水平的Nei’s 基因多样性（H）均值为0.3074，表明翠柏的遗传多样性较高。其中居群内的基因多样度（Hs）为0.1826，居群间的遗传多样度（Dst）为0.1248，居群间的遗传分化系数（Gst）为0.4060，基因流（Nm）为0.7318，这表明在化感作用影响下翠柏居群间的遗传分化较小，其遗传变异的大部分来源于居群内部。聚类分析结果显示与地理分布有显著相关性。这为翠柏的遗传图谱构建和保育等研究提供了参考。在本研究中虽然大多数翠柏的遗传变异率在84%以内，其多样性较低，而不是在种群之间，其分化程度远大于其他针叶树种。本研究中的14个样本中有9个种群种群偏离了HW平衡。所有的结果表明，翠柏种群数量在下降。此外，它们的板块化可能也受到长期的历史事件以及独立的进化过程影响。因此，对现存的翠柏群体尽可能地进行迁地保护或者繁殖。