碱性造纸黑液菌群结构分析及其在黑液处理、可再生资源利用中的功能菌群和功能基因研究

极端碱性环境微生物因其具有特殊的基因类型、生理机能和代谢产物，蕴藏着极大的科学和应用价值而成为世界生物学研究的热点之一。草浆碱法造纸黑液是一种高pH、高COD负荷的强碱性人工废水，一般微生物很难在其中生存。该申请拟以一组在造纸黑液中自然形成、且对造纸黑液有显著处理效果的菌群为研究对象，以春夏秋冬四个季节的菌群结构和处理效果为出发点，通过分子生态学和微生物培养相结合的方法，研究该菌群的结构特点、获得在造纸黑液处理中的功能菌株并构建高效稳定的人工菌群。同时通过构建宏基因组和基因组文库等方法筛选新型高效的纤维素和半纤维素降解基因，进行基因分析表达并对表达产物性质进行研究。该研究不仅具有较好的极端污染环境微生物生态学意义，而且在处理草浆碱性造纸黑液、促进草浆造纸工艺的全球普及、节约森林资源上具有重要的理论研究和应用价值，还可为可再生资源的利用和极端环境污染物的处理提供有价值的微生物资源。

首先，分别在春夏秋冬四个季节取样分析不同季节菌群结构差异。结果表明该菌群由Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria三个门菌株组成。四个季节的菌群结构存在明显差别。Halomonas和Atopostipes克隆在夏秋两个样品中的比例明显高于春冬样品。使用不同培养基对秋天样品进行分离同样获得了比例较多的Bacillus、Alkalibacterium、Clostridium、Halomonas等属的菌株。该研究成果已经发表在“Bioresource Technology”上（2010, 101: 1737–1744）。.基于Halomonas在造纸黑液处理中的重要作用，对分离获得的Halomonas sp.19-A和Y2进行了代谢多样性分析。发现这两株菌具有较强的产酸、降解黑液pH的能力。同时具有降解联苯、香兰素等环境污染物的能力及产生各种水解酶的能力，具有重要的应用价值。该研究成果已经发表在“Bioresource Technology”上（2010, 101: 6778–6784）”。.该造纸黑液池因为环境问题废弃不用，基于其沉淀污泥中存在大量的木质纤维素且现场检测到大量的甲烷气体，对该黑液池池底污泥中的细菌、古菌、纤维素降解菌及甲烷产生菌进行了分析。结果表明其中的古菌主要由甲烷古菌和Halobacteriaceae组成。经mcrA克隆文库分析，甲烷古菌以产甲烷囊菌属(Methanoculleus)中的一类新型菌株为主。其中纤维素降解菌株以能够产生GHF48的菌株尤其是梭菌为主。该研究成果已经发表在“Water Research”上（2013, 47: 683-692）。.从造纸黑液废水中构建宏基因组文库并筛选到一个编码6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的新型基因。最终成功异源表达出有活性的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶。在多序列比对分析和同源建模基础上，结合定点突变技术，对其中的7个关键位点在酶结合磷酸化底物中的作用进行了分析。研究结果已投稿到“Applied Environmental Microbiology”上，已接收。