罗非鱼骨骼肌组织糖利用的调控机理研究

Previous studies have shown that insulin transport blood glucose to the peripheral tissue through insulin receptor and insulin receptor-mediated signal transduction action, but the mechanism and degree was not sure. The present study was to analyze the intrinsic tyrosine kinase activity of insulin receptor and its phosphorylation level in peripheral tissues (skeletal muscle) under different carbohydrate level diet,and understand the transmission signal potential of insulin receptor;research the tissue-specific characteristics of affinity of the insulin and insulin receptor in tilapia skeletal muscle through ligand binding experiment;and study the transduction capacity of insulin receptor-mediated signal by Western blotting,partly reveal the reasons of low sugar utilization. Tilapia muscle cell will be cultured in vitro to study the effect of signal transduction activation or inhibition on the glucose transporter GLUT4 gene expression and translocation and glucose uptake, clarifying the role of insulin receptor and signal transduction and the key points of insulin regulating glucose metabolism.The purpose of this research is to improve fish sugar utilization, alleviate shortage of protein feed resources and promote the sustainable development of aquaculture.

已有研究表明，胰岛素依靠胰岛素受体及其介导的信号转导将血糖转运到外周组织利用,但鱼类胰岛素受体及介导的信号转导在血糖转运中的作用机理以及程度不明。本文研究不同碳水化合物水平日粮条件下，罗非鱼外周组织（骨骼肌）胰岛素受体的内在酪氨酸激酶活性TKA所拥有的磷酸化水平，了解胰岛素受体传输细胞内信号潜力；通过配体结合试验，研究罗非鱼骨骼肌组织胰岛素受体与胰岛素结合力的组织特异性特点；通过Western免疫印迹法研究胰岛素受体介导信号转导能力，部分揭示影响罗非鱼糖利用率低的原因。通过体外培养细胞，研究信号转导的激活或抑制对骨骼肌组织葡萄糖转运蛋白GLUT4基因表达及转位、葡萄糖摄取的影响，弄清鱼类胰岛素受体及信号转导在胰岛素功能发挥中起的介导作用,以期找到胰岛素调节糖代谢的关键点。本课题研究目的是如何提高鱼类的糖利用效率,缓解我国蛋白饲料资源的不足，促进水产养殖业的可持续发展。

为了提高糖类的利用，研究糖类代谢机理，从理论上提出解决这一问题的技术措施。克隆 IR-1 cDNA 片段，其GenBank登陆号为JN967750，大小为1979bp，编码548个氨基酸。克隆GLUT4 cDNA片段，GenBank 登录号 JN900493，603bp，编码200个氨基酸。IR-1在肌肉、心脏和肝脏中有较高的表达水平。GLUT4在肌肉、GLUT2在肝脏中的表达水平最高。注射葡萄糖后即刻升高了罗非鱼的血浆葡萄糖含量，相对于血浆葡萄糖含量的升高，血浆胰岛素含量的升高相对延迟，而肌肉和肝脏中IR-1 mRNA相对表达量的提高又延迟于血浆胰岛素含量的升高，从而加重了罗非鱼对葡萄糖的代谢负担。注射葡萄糖后心肌中GLUT4 mRNA水平快速升高，而外周组织骨骼肌中GLUT4 mRNA相对于血糖升高反应严重滞后，影响了血糖向外周组织的转运，从而加重了鱼类对葡萄糖的代谢负担。研究了铬对罗非鱼生长以及对肝脏和肌肉胰岛素受体IR及葡萄糖转运蛋白GLUT基因表达的影响。1.8mg/kg Cr显著提高了肌肉、肝脏IR-1和肌肉GLUT4的基因表达，一定剂量的Cr正调节了罗非鱼骨骼肌GLUT-4基因表达。高剂量Cr可以提高血糖从细胞膜外向细胞膜内的转运，提高了血糖利用，为鱼类提供更多的能量，使得罗非鱼可以耐受一定的低温环境。低蛋白日粮添加1.8m/kg铬生产性能达到了高蛋白水平的生产性能。研究了不同水平淀粉和不同糖源对罗非鱼生长、胰岛素受体水平、胰岛素受体结合力和酪氨酸激酶活性的影响。结果表明，适量水平的淀粉日粮，提高了肌肉中胰岛素受体的结合力，提高了肌肉和肝脏中胰岛素受体（IR-1）基因mRNA的表达，增加了肌肉组织中酪氨酸激酶浓度，提高了罗非鱼对日粮碳水化合物的利用。研究了糖代谢激活调控剂对罗非鱼生长、骨骼肌PI3K/Akt信号转导途径以及骨骼肌MAPK信号转导途径的影响。结果表明，一定剂量的糖代谢调控剂可以使罗非鱼耐受更高量的碳水化合物日粮，罗非鱼饲料中可以耐受不超过36%的淀粉。结果表明，合适的投喂和饲料配方策略，罗非鱼可以耐受较高水平的淀粉，不但节省了饲料和养殖生产成本，也减少了水体中的氮排放，提高了水产养殖的生态可持续性发展。