天然木糖利用麦芽糖假丝酵母葡萄糖阻遏效应及其调控机理研究

The glucose repression dramatically affects metabolic regulation of carbon resource. It typically resluts in the preferential utilization of glucose in the naturally occurring xylose-fermenting yeast Candida maltosa, and subsequently lowered overall yield and productivity of fermentation production. Therefore, the comprehensive understanding of the glucose repression will promote to elucidate regulatory mechanism of mixed sugar metabolism in C. maltosa and other xylose-fermenting yeasts. In this study, we propose to investigate the key participants of glucose repression: Snf1 protein complex/Mig1 protein and their related regulatory regions based on genome sequencing and analysis of C. maltosa. By gene disruption, functional complementation, protein/protein, protein/nucleic acid interactions, mass spectrometry and fluorescent protein positioning technologies, the functionalities of the Snf1 and Mig1 protein (complex) from C. maltosa would be characterized and the phosphorylation sites of Mig1 and phosphorylated proteins be identified. These results would facilitate to understand that the physiological role Snf1 and Mig1 in C. maltosa, develop the new strategies to remove the glucose repression, and achieve the effective simultaneous utilization of mixed sugar in yeast.

葡萄糖阻遏效应在酵母菌糖代谢调控中普遍存在。天然木糖利用麦芽糖假丝酵母混合糖发酵时葡萄糖优先利用就是葡萄糖阻遏效应的典型表现，从而导致发酵过程的总糖转化率和生产强度降低。因此，全面理解葡萄糖阻遏效应及调控机理可以促进相关酵母菌混合糖同步共利用的应用。本项目在前期基因组测序分析的基础上，重点发掘与表征葡萄糖阻遏效应关键节点的的Snf1/Mig1基因及相关调控区等,通过基因敲除与功能互补、蛋白与蛋白,蛋白与核酸分子相互作用、质谱技术及荧光蛋白定位技术等鉴定麦芽糖假丝酵母Snf1蛋白和Mig1蛋白的生理功能，发现Mig1的磷酸化位点和磷酸化蛋白在细胞内的定位变化等。整合相关研究结果解析功能蛋白的相互关系及其在调控信号传递过程中的运作方式和在混合糖代谢中发挥的生理作用。最终为完整揭示葡萄糖阻遏效应及调控机理提供基础，为改善混合糖利用效率提供新策略。

葡萄糖阻遏效应在酵母菌糖代谢调控中普遍存在。天然木糖利用麦芽糖假丝酵母混合糖发酵时葡萄糖优先利用就是葡萄糖阻遏效应的典型表现，从而导致发酵过程的总糖转化率和生产强度降低。因此，全面理解葡萄糖阻遏效应及调控机理可以促进相关酵母菌混合糖同步共利用的应用。本项目首先对天然木糖利用麦芽糖假丝酵母的单糖和混合糖代谢性能进行了系统评价，结果表明当葡萄糖与木糖浓度比大于3:1时，葡萄糖强烈抑制木糖的利用，在小于3:1时，可以推进葡萄糖、木糖的共同利用，同时发现麦芽糖假丝酵母具有类似于酿酒酵母进行有氧发酵的Crabtree效应，表明该菌的葡萄糖阻遏系统具有类似于酿酒酵母的调控机制。通过分析葡萄糖、木糖及其混合糖条件下的转录组，结合前期基因组测序结果，初步解析力全基因组水平上受葡萄糖阻遏的转录表达谱，发现了多个可能与葡萄糖阻遏效应相关基因，包括SNF1、SNF2、SNF7、HXK、MIG1、GAL4 和HXT6等。麦芽糖假丝酵母混合糖发酵的转录组分析表明，与发酵前期相比，发酵后期高亲和性葡萄糖转运蛋白的表达水平显著上调，超过100倍。当葡萄糖已经消耗完全，此时的糖转运蛋白推测是转运木糖，参与木糖代谢过程。单糖发酵的转录组分析表明，与木糖代谢相比，葡萄糖代谢中的SNF2基因表达上调10倍。通过对麦芽糖假丝酵母糖转运蛋白进行了功能表征，挖掘了木糖转运的关键蛋白T1和T3。另外，在木糖利用的工程酿酒酵母工业菌株W32N55中，我们研究了参与葡萄糖阻遏响应的关键基因SNF1和MIG1的敲除对混合糖发酵的影响，结果表明SNF1基因的敲除，在葡萄糖代谢过程中，乙醇产量有所增加，可能是由于SNF1基因的缺失对乙醛脱氢酶启动的催化乙醛氧化为乙酸的生化反应起到了一定的阻断作用，从而使乙醇的生成量有所增加，而MIG1基因的缺失造成糖代谢速度减慢。综上所述，本项目的研究挖掘了可能参与麦芽糖假丝酵母葡萄糖阻遏效应的关键基因，揭示了在该菌中限制葡萄糖和木糖共利用可能机理是葡萄糖诱导一些参与葡萄糖阻遏效应关键基因的表达，同时抑制木糖转运蛋白的表达。这些研究结果有助于我们全面理解天然木糖利用酵母的葡萄糖阻遏效应，为提高天然木糖利用酵母混合糖共利用效率奠定了理论基础。