胎儿皮肤增殖和分化过程中靶向ΔNp63的关键miRNA筛选及其调控机制研究

Wound healing has long been an insurmountable clinical problem, recent study identified the presence of "incognito healing" phenomenon on fetal skin , at the same time，p63 has a crucial role in regulating epidermal and other keratinized epithelial formation and maintenance. P63 lacking mice unable to form epidermis or squamous epithelium, precisely because of its isomers -ΔNp63 which plays a key role in this process. This project intends to use fetal skin in different embryonic age and adult skin tissue,thorugh miRNA expression profiling and bioinformatics analysis, to screen the key miRNA targeting ΔNp63 directly, after that，dual luciferase reporter gene will beutilized to confirm their combination.Futhermore,miRNA mimics and miRNA inhibitor will be utilized to validate the exact funtion of miRNA in proliferation and differentiation process of human epidermal stem cell . Finally,we try to downstream regulatory pathways with gene array and antibody array, and predicted pathway will be tested using PCR and western blot.thus we can clarify the undelying modulation mechanism of miRNA targeting ΔNp63 on how to regulate epidermal proliferation and differentiation , and differential expression modulation between fetal and adult skin of miRNA regulation , and lay the fundation towards epidermis development study、clinical wound repair and tissue engineering skin.

皮肤的创伤修复一直是临床治疗的难题，而研究发现胎儿皮肤存在“无痕愈合”的现象; p63-/-的小鼠无法形成表皮或鳞状上皮，正是由于其异构体—ΔNp63在这一过程中发挥了了关键作用。本项目拟选用不同胚龄胎儿皮肤和成人皮肤组织，通过miRNA表达谱鉴定和生物信息学分析，筛选直接调控ΔNp63的关键miRNA，并通过双荧光素酶报告基因验证二者的结合，并通过miRNA mimics 和miRNA inhibitor 验证其在人表皮干细胞增殖分化中的作用，并进一步运用gene array 和antibody array，对其下游调控通路进行筛选，并通过荧光定量PCR和western blot进行鉴定，以阐明miRNA在靶向ΔNp63调控表皮增殖分化中的作用机制，及胎儿皮肤和成人皮肤miRNA对皮肤发育的差异调控，并进一步对表皮的发育研究、临床创伤的修复和组织工程皮肤的构建奠定基础。

基于烧伤，烫伤及各种外伤所致的皮肤缺损问题，本项目采集不同胚胎胎儿皮肤，并进行小RNA测序，筛选获得人皮肤发育早期和晚期差异表达的miRNA，并通过进一步的筛选，对其中的若干miRNA分子，包含let-7b-5p、miR-519d-5p和miR-519e-5p 等，进行细胞水平功能和机制验证。首先通过早晚期表达量的对比筛选出了373个差异表达的miRNAs，通过网站预测、生物信息学分析，与ΔNp63结合情况及现有的文献报道结果相结合最终选定了2个miRNA family，并在这两个family中选择了5个miRNAs与进行了细胞水平的验证。结果表明let-7 family随着皮肤的发育表达量出现了显著增加，有促进皮肤发育的趋势；miR-515 family随着皮肤的发育表达量显著降低，有抑制皮肤发育的趋势。在细胞水平上，let-7i-5p和let-7c-5p促进细胞的增殖抑制凋亡，let-7b-5p、miR-515家族的miR-519d-5p和miR-519e-5p影响ΔNp63的表达，抑制细胞的增殖并促进其凋亡。我们挑选了let-7b-5p利用双萤光素酶报告基因实验验证了其与ΔNp63的结合，并利用Weternblot和荧光定量PCR实验检测到let-7b-5p对ΔNp63的表达水平有抑制作用,并影响PI3K-AKT-mTOR通路上明星分子的mRNA及蛋白的表达情况。综合上述结果，本研究为探讨miRNA参与ΔNp63调节胚胎皮肤发育过程中的相关机制奠定了坚实的工作基础。不仅发现了影响皮肤发育的两大miRNA家族并进行的实验的验证同时还发现let-7b-5p通过调控ΔNp63的表达影响PI3K-AKT-mTOR通路对HaCaT细胞发挥作用。本研究对认识miRNA家族成员之间的关系提供了重要的启示性线索。