不同剂量氟对人成骨细胞DNA甲基化水平及调控的影响研究

Excess fluoride in the environment has long-term effects on the osteoblasts to be proliferated, leading to the accelerated bone turnover, which is a major cause of skeletal fluorosis. But under the same level of fluoride exposure, the pathological bone changes in patients, ward morbidity and individual susceptibility are quite different, and still there are disease reversal and fluorine metabolic memory after fluoride decreased in some ward. We speculate that this may be the results when the osteoblast cell genome adjust by epigenetic modifications to adapt to the excess fluoride environment, not only produces toxicological effects, even results in heritable phenotypic changes, showing a significant environment - epigenetic effects. In this study, by genome-wide Methylated DNA immunoprecipitation chip (MeDIP-chip) technology and MassARRAY system detection, we test DNA methylation differences of the human osteoblast exposed to fluoride in gene profile, screen the skeletal fluorosis related genes and genetic methylation sites, and furtherly verify their function and expression. We explore the epigenetic reaction and genomic adaptation of osteoblast in the skeletal fluorosis, and try to provide the experimental and theoretical basis of early molecular pathogenesis and screening, to gather the scientific materials of the environment-gene research.

环境中过量氟长期作用于机体成骨细胞，使其持续增生活跃，导致骨转换加速，是氟骨症发生的主要病因。但在相同氟暴露水平时，患者骨骼病理改变、病区患病率与个体易感性存在较大差异，同时病区改水后有部分病情逆转及氟代谢记忆现象发生。我们推测这可能是过量氟长期作用下，机体成骨细胞基因组通过表观遗传学修饰方式适应环境、调整自身的结果，不仅产生毒理作用，甚至叠加为可遗传的表型改变，呈现出明显的环境-表观遗传效应。本研究采用全基因组DNA甲基化免疫共沉淀芯片技术，结合MassARRAY质谱分析与细胞功能实验，检测不同剂量氟作用后体外培养人成骨细胞中DNA甲基化差异基因谱，筛选出氟骨症表观遗传相关基因及甲基化位点，并进一步验证其功能与表达，初步探讨氟作用后成骨细胞基因组的表观遗传反应与适应方式，为氟骨症早期分子发病机制与早期筛查提供实验与理论依据，为环境-基因相互作用研究与应用积累科学资料。

环境中过量氟长期作用于机体成骨细胞，使其持续增生活跃，导致骨转换加速，是氟骨症发生的主要病因。本课题通过建立染氟成骨细胞体外模型，采用不同剂量氟化钠、不同时间干预成骨细胞，采用MTT 法与流式细胞仪检测成骨细胞的增殖与凋亡情况，确定了促进细胞增殖与凋亡的染氟剂量、染氟时间以及对氟作用敏感的成骨细胞系。采用illumina甲基化850k芯片检测不同剂量染氟成骨细胞甲基化位点的甲基化程度及差异情况。结果显示，与对照组相比，染氟后成骨细胞中有2050±606个差异甲基化位点甲基化程度大于非甲基化程度，涉及基因1579±445个；有2366±689个差异甲基化位点甲基化程度小于非甲基化程度，涉及基因1848±538个。随染氟剂量增大，大于、小于非甲基化程度的差异甲基化位点数与相关基因数也随之增大（R=0.77），即氟作用于成骨细胞后，可引起相关基因的甲基化变化。对差异基因谱中的基因进行 GO 分类与功能富集分析，主要相关功能集中于细胞组成与脂肪酸降解、脂肪细胞因子信号通路、Apelin信号通路、胰高血糖素信号等通路。结合氟骨症分子发病机制，筛选出甲基化差异目标基因群，包括BMP2、BGP、MGMT、MLH1、DNMT1、DNMT3A及DNMT3B等，继续观察与分析其甲基化程度与氟剂量、成骨细胞增殖之间的相互关系。选择成骨细胞甲基化差异表达基因BGP，检测其在体内的表达及相关功能的变化，结果显示，高剂量氟引起成骨细胞BGP高表达，抑制脂肪的积累，增加脂质代谢；降低机体抗氧化应激酶的活性，致使总抗氧化能力下降；仔鼠破骨细胞活性增加，骨转换加速，影响骨质的生长发育。