慢病毒载体在成年胰岛产生机制研究新策略中的应用

成年胰腺中存在多种细胞形态，如胰岛、胰管和腺泡，各细胞种类之间又可发生复杂的转分化现象。本研究通过构建一种新型的细胞标记技术和建立新的胰腺注射模型，实现对胰腺各细胞种类的追踪，从而阐明成年胰腺的发育机制，为糖尿病的治疗探索新的途径。我们拟在已有的基础上，开展如下研究：（1）一种基于慢病毒载体的新型细胞追踪技术的建立，包括：以重组酶（Cre、Flp）、重组位点（Lox、Frt）、报告基因（EGFP、DsRed）和胰腺特异启动子为元件组装成的慢病毒载体，慢病毒颗粒的大批量生产及浓缩，载体特异性标记胰腺细胞的体外检测；（2）两种小鼠胰腺慢病毒灌注模型的建立，包括：胰管灌注模型的建立及检测，胰腺动脉灌注模型的建立及检测；（3）成年胰腺发育及胰岛质量维持机理研究，包括：鉴定通过胰管内干细胞分化形成的新胰岛，鉴定通过现有胰岛分裂产生的胰岛，研究胰腺再生模型中胰岛的产生机制。

本项目经课题组成员三年来的努力工作，已顺利完成或超过预定目标，取得的主要成果汇报如下：.1. 建立小鼠胰腺动脉腺病毒载体灌注途径，其中，百分之六十的Beta细胞表达报告基因，实验结果同时表明，胰岛特异性表达Sirt1基因，可以保护胰岛Beta细胞免受链尿霉素诱导的凋亡。研究成果已发表在著名杂志Molecular Therapy 2011.2. 首次发现烟酸受体PUMA-G在小鼠胰岛Beta细胞上的表达，并且，其信号通路可以调控胰岛素的表达，研究结果已发表在Pancreas 2011 .3. 利用生物聚酯材料PHBHHx制备微米颗粒，并将腺病毒载体吸附于其表面，研究表明，该复合物可以介导胰腺毛细血管的基因转移，研究结果已发表在Journal of Gene Medicine 2012 .4. 与协和大学的韩代书教授合作，研究LPS对巨噬细胞吞噬作用的影响，研究结果已发表在Immunology 2011 .5. 与印度细胞科学国家中心的Hardikar教授合作，建立了单细胞定量检测miRNA表达技术，研究结果已发表在Cold Spring Harbor Protocol, 2010 .6. 利用PCR技术，对重组酶Cre进行点突变，将173位置的氨基酸从精氨酸变为组氨酸，降低了Cre的酶活性，从而达到提高胰岛素启动子的组织特异性。研究结果正在整理，准备投稿。.7. 该结果同时申请了一项国内发明专利：DNA 重组酶Cre 基因的改造、重组蛋白表达方法及应用。专利申请号：20111029620.2。.8．构建表达胰腺发育关键转录因子的腺病毒载体，并用以诱导脐带间充质干细胞的诱导，研究结果正在整理，准备投稿。.9．构建了可诱导表达VSV-G的Ad293细胞株，利用脂质体挤压技术，成功地实现了蛋白质向细胞的转移，研究结果具有重要意义，为将来的基金申请打下基础。.10. 构建了NF-kB报告基因，发现PUMA-G的信号可以抑制NF-kB的激活，可能有助于保护Beta细胞，研究结果具有重要意义，为将来的基金申请打下基础。.11. 本项目的顺利进行，帮助成功申请了国家自然科学基金面上项目1项，和广东省重点基金1项。