新型非病毒类整合性载体的构建及在1型糖尿病防治中的应用

《科学》杂志将基因治疗的回归评为2009年的重大突破之一。本研究通过构建一种具有自主知识产权的L-病毒体，结合非病毒类载体的安全性和病毒类载体的高效性，实现胰岛特异性稳定表达吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）基因，建立胰腺局部性免疫抑制环境，探讨对1型糖尿病的防治作用。.我们拟在已有的基础上，开展如下研究：（1）构建一种新型具有整合能力的DNA质粒，包括：慢病毒载体的改造、整合酶的克隆、整合能力和特征的检测；（2）建立纳米级含VSV-G胞膜的L-病毒体，包括：VSV-G在HeLa细胞中的表达、诱导产生细胞膜小泡、L-病毒体的制备及表征；（3）IDO在NOD小鼠胰岛中的稳定表达和对糖尿病的防治作用研究，包括：通过腹腔干灌注IDO-L-病毒体、胰岛特异性表达IDO的检测、胰岛的保护及1型糖尿病病症的检测、胰岛特异性T细胞及免疫炎症的检测。

糖尿病是一种严重的代谢性疾病，可大致分为I型和II型糖尿病。世界上有超过二亿五千万患者，中国可能有多达七千万，成为世界最多糖尿病发病国。因而，研究胰岛Beta细胞的发育机制，及基因与药物的高效递送，对糖尿病的防治具有重要意义。本项目通过改造Cre-loxP系统，改善了胰岛Beta细胞标记的特异性，为阐明成年胰腺的发育机制提供了有力工具；本项目还发明了一种新技术，制备包含线粒体等细胞器的膜颗粒，同时整合了具有融膜特性的VSV-G蛋白，实现了线粒体的有效转移，这为治疗线粒体缺陷型疾病（包括糖尿病）探索了新的途径。在此基础上，本项目还探讨了新的DNA与RNA细胞转运技术。.本项目经四年来的努力，已基本完成制定的目标，取得了一些有意义的成果，对研究胰腺发育和糖尿病的治疗具有重要的指导作用，具体而言，1）我们发现胰岛素启动子RIP介导的细胞标记系统Cre-loxP，在体外细胞标记实验中产生严重的非特异性；通过点突变改造Cre重组酶，减弱其酶活性，使非特异性降低到检测水平以下，同时对Beta细胞的标记效率仅微弱下降。2）发现CreER-loxP在无诱导物存在下发生大量的自发重组，我们构建了膜定位的Cre系统，通过诱导二聚化，将Cre从膜定位中释放，有效消除了自发重组现象。3）利用3微米孔径的聚碳酸酯薄膜和针头过滤器，挤压Ad293细胞，制备3微米细胞膜颗粒，内含线粒体等细胞器；细胞膜整合了VSV-G蛋白，具备细胞膜融合功能，促进了细胞间线粒体的有效转移。4）利用VSV-G及红细胞血影，我们实现了DNA及总RNA的高效转移。5）由于VSV-G在病毒载体假型及基因转移中的重要应用，我们构建了VSV-G的毕赤酵母表达系统，其细胞裂解液及原生质体分泌液均有VSV-G蛋白产物，并具有多种生物学活性。6）研究中，我们还首次发现人胰岛beta细胞表达烟酸受体GPR109A；并且，在2型糖尿病患者及胰岛素瘤中，GPR109A的表达严重下降，提示GPR109A在糖尿病防治中可能有重要作用。7）我们还与汕头大学医学院的许文灿教授展开合作，取得了良好的研究结果。.总而言之，本项目的研究已基本完成预定计划并有所扩展，而有些内容由于某些原因推迟进行。研究结果为探索胰腺发育机制及糖尿病防治提供了新的途径和方法，为实验室的后续发展打下坚实的基础。