基于噬菌体展示短肽的多溴联苯醚非竞争性免疫分析

多溴联苯醚（PBDEs）是一类全球性的环境污染物质，其中4～6溴代联苯醚在环境和生物样品中分布广且毒性大。本项目针对目前PBDEs仪器分析方法复杂且效率不高的缺点，以环境中几种重要的4～6溴代联苯醚（BDE-47, 99, 100, 153和154）为目标，研究一种新的免疫分析方法。本研究首先需要制备PBDEs特异性的多克隆抗体，再以抗体-PBDEs免疫复合物为模板配基，利用噬菌体展示肽库技术筛选出识别免疫复合物的特异性短肽，建立基于噬菌体展示短肽的PBDEs非竞争性免疫分析方法，并应用于环境样品实测，最后将该方法与仪器分析方法比较，评价它的实用性。本研究建立的新方法将克服目前PBDEs竞争性免疫分析法灵敏度低且特异性差的缺陷，它可作为精密仪器分析方法的补充，对PBDEs的环境污染实施快速有效监控。

本项目以毒性较大且在环境中分布广泛的2,2′,4,4′-四溴联苯醚（BDE-47）为目标，研究基于噬菌体展示短肽的BDE-47免疫分析方法。通过在BDE-47化学结构式中引入含4个碳臂的丁酸功能基团，获得了BDE-47的半抗原，将半抗原与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联作为免疫原，免疫小鼠制备几种BDE-47的单克隆抗体。将5-(2,4-二溴苯氧)戊酸与辣根过氧化物酶（HRP）偶联制备了酶标半抗原，与其中一种单克隆抗体4F2组合，建立了BDE-47直接竞争性ELISA方法，标准曲线的抑制中浓度（IC50值）和最低检测浓度（LOD值）分别为1.4 ng mL-1和0.1 ng mL-1，ELISA方法与其它测试化合物的交叉反应≤5.8%。将该方法应用于土壤、河床底泥以及室内灰尘中BDE-47的检测，平均添加回收率、重复性和再现性分别为92-126%、8-19%和9-25%，将ELISA方法与气质联用方法同时检测44个环境样品，两种方法的检测结果有较好的相关性(R2 = 0.79–0.85)。. 以另一种单克隆抗体1H2为筛选模板，总共从展示环7肽、线性7肽和线性12肽的3种随机肽库筛选出25个阳性噬菌体克隆，能与单抗1H2特异结合或与单抗1H2-BDE-47免疫复合体结合。利用其中一株与单抗1H2特异结合的噬菌体C7-1建立了竞争性噬菌体ELISA，标准曲线抑制中浓度IC50=6.8 ng mL-1；同时利用另一株与免疫复合体结合的噬菌体XC7-8建立了非竞争性噬菌体ELISA，标准曲线中使OD值升高的中浓度EC50=4.2 ng mL-1。竞争和非竞争噬菌体ELISA方法与BDE28、BDE99和BDE100的交叉反应分别为0.3–0.8%和1.3–6.5%。将两种噬菌体ELISA方法都用于污泥和鱼肉样品中BDE-47的分析，竞争性方法的平均添加回收率、重复性和再现性分别为96–124%, 4.5–11%和5.5–16%。非竞争性方法的相应值分别为97–120%, 3.5–10%和7–15%。两种方法对18个实际样品的分析结果基本一致，另将噬菌体ELISA与气相色谱-电子捕获检测器的离子阱质谱仪（GC/ITMS）对比分析，结果也相近。本项目研究结果表明，利用噬菌体展示技术可以方便高效的筛选出针对小分子污染物的特异性短肽，并建立不同的噬菌体ELISA方法。