四溴双酚A纳米抗体免疫磁珠的构建及其在水污染分析中的应用

Tetrabromobisphenol A (TBBPA) has the largest worldwide market among all of the brominated flame retardants. It is a general pollutant and ubiquitous in water bodies. There are indications about the potential toxicity of TBBPA as an immunotoxic, neurotoxic and endocrine disrupting compound. The extraction and separation of TBBPA from water bodies proved to be a challenge due to its low concentration and high lipophilicity. We plan to construct two types of immunomagnetic beads based on a nanobody (VHH) speicific for TBBPA by genetic engineering technology. For the first type, the genes encoding nanobody and magnetosome membrane protein are cloned and transformed into Magnetospirillum gryphiswaldense for the expression of magnetosome-nanobody complex. For the second type, the genes encoding nanobody and biotin acceptor domain (BAD) are cloned and transformed into WK6 cells for the expression of fusion protein (BAD-VHH) which could be combined to free biotions by the catalyzation of a biotin protein ligase. The biotinylated nanobody would be connected to streptavidin labelled magnetic beads. The production of the above immunomagnetic beads are cost-effective because both nanobody and magnetosome can be easily expressed in recombinants with large volumes. After the optimization of reaction conditions between immunomagnetic beads and TBBPA, the nanobody-based immunomagnetic beads would finally be applied to the separation and analysis of TBBPA in the drainage from different TBBPA manufacture plants, effluent of sewage treatment plants and downstream surface water of sewage treatment plants.

四溴双酚A（TBBPA）是全球用量最大的一种溴阻燃剂，也是一种全球性的污染物，广泛分布于水环境中。TBBPA具有免疫和神经毒性，同时也是一种潜在的内分泌干扰物。本项目针对目前水环境中TBBPA难分离分析的特点，利用生物工程技术构建两种新的基于TBBPA纳米抗体的免疫磁珠，用于吸附分离水体中的TBBPA，提高其分析效率和灵敏度。一种是直接将TBBPA纳米抗体展示在趋磁细菌Magnetospirillum gryphiswaldense的磁小体蛋白膜上，获得纳米抗体-磁小体复合物；另一种是将纳米抗体生物素化后固定在链霉亲和素磁珠上，获得生物素-亲和素介导的免疫磁珠。由于纳米抗体及磁小体可以通过构建重组菌发酵大量获取，所以免疫磁珠的制备成本很低。免疫磁珠吸附TBBPA的条件经优化后，将它用于TBBPA生产厂排放废水、生活污水处理厂出水及出水口下游地表水中TBBPA的吸附分离，然后定量分析。

四溴双酚A（TBBPA）是全球用量最大的一种溴阻燃剂，也是一种全球性的污染物，广泛分布于水环境中。TBBPA具有免疫和神经毒性，同时也是一种潜在的内分泌干扰物。本项目构建了两种新的基于TBBPA纳米抗体的免疫磁珠：一种是利用生物技术将纳米抗体修饰后再定向固定在磁小体（BMP）上；另一种是直接将纳米抗体与磁小体膜蛋白融合表达。将获得的纳米抗体-磁小体复合物用于水环境中TBBPA的检测，提高了分析效率和灵敏度。本项目所获得的主要结果如下。.1）在TBBPA纳米抗体C末端修饰融合表达半胱氨酸（Cys），然后利用双功能螯合剂SPDP将半胱氨酸-SH与磁小体上的-NH2连接，纳米抗体被定向锚定于磁小体上。用磁小体复合物建立的免疫分析方法IC50为1.04 ng/mL，用于定量分析河水及底泥中TBBPA残留，水体中TBBPA浓度<LOD，而底泥中的浓度<LOD−23.4 ng/g (dw)之间。.2）利用生物技术将TBBPA纳米抗体同时多价化和生物素化，用化学方法将磁小体与链霉亲和素偶联，再将多价化的抗体通过生物素-亲和素反应固定于磁小体上构建复合体（BMP-SA-Biotin-Nbs），三价化的抗体亲和力和稳定性明显高于二价和单价抗体，用三价化抗体建立的ELISA方法在100%甲醇中检测TBBPA的IC50为0.42 ng/mL。用于检测污水、污泥和填埋场渗滤液中的TBBPA，浓度分别为<LOD−0.75 ng/mL, <LOD−3.65 ng/g (dw)和 <LOD−1.17 ng/mL。.3）将TBBPA纳米抗体 磁小体膜蛋白融合基因插入到自杀质粒的多克隆位点处得到重组质粒，将重组质粒转移至野生型磁螺菌中，获得的重组磁螺菌即可在磁小体膜上展示靶标纳米抗体。该免疫磁珠复合物同时具有磁性分离和识别TBBPA的双重功能，可用于TBBPA的检测、吸附和富集。基于基因工程技术制备出纳米抗体 磁小体免疫磁珠复合物，相较传统的化学偶联方法具有生产成本低、周期短、易于纯化等明显优势。.本项目建立的基于纳米抗体-磁小体复合物的分析方法，具有操作简单快速、特异性强、成本低且对环境友好等特点，对实时监测水环境中TBBPA 的迁移转化规律具有重要的意义。