弓形虫SNARE蛋白在分泌性细胞器生物发生过程中的作用机制研究

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite of Apicomplexa. This parasite could cause infection in many animals and human being and lead to important zoonotic diseases. T. gondii possesses a highly polarized secretory system, and through which, parasites secret large amount of proteins outside of parasites and into host cells. These secretory proteins are critical for invasion and survival of parasites. Therefore, it is important to understand how this parasite regulate transportation of secretory proteins, biogenesis of secretory organells and protein secretion for development of therapeutic tools against toxoplasmosis. The recent findings suggest that T. gondii has functionally repurposed evolutionarily conserved regulators of the endosomal system to the secretory pathway to transport secretory proteins and form secretory organelles. However, it is still not clear how the biogenesis of secretory organells is regulated in T. gondii. SNARE family proteins are major mediators of vehicle fusion in eukaryotic cells. In this study, the function of SNARE proteins on the biogenesis of secretory organells will be investigated through conditional knockout methods. The components of related SNARE complex will be identified through immnoprecipitation assay. Furthermore, the subcellular localization of the SNAREs and their interactions will be studied to elucidate the molecular mechanism involved in the biogenesis of secretory organells. The findings of this study will provide a theoretical basis for the development of therapeutic measurements against T. gondii.

弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，能够广泛感染人和恒温动物有核细胞，引起重要的人兽共患寄生虫病。弓形虫需要通过高度极化的分泌性细胞器分泌大量感染相关蛋白，从而入侵宿主细胞和建立感染。因此，了解弓形虫分泌蛋白转运的分子机制对弓形虫病防控具有重要的意义。但是目前弓形虫分泌性细胞器生物发生的分子机制尚不清楚。本项目拟筛选相关SNARE蛋白，采用条件性敲除等方法研究弓形虫SNARE蛋白在分泌性细胞器生物发生过程中的作用；利用免疫共沉淀等方法鉴定相应SNARE复合物；通过免疫荧光实验等方法分析相应SNARE复合物蛋白在细胞内的定位和复合物分子间的相互作用，进而阐明SNARE蛋白及相关复合物在弓形虫分泌性细胞器生物发生过程中发挥功能的分子机制。本项目的研究成果将为开发弓形虫病治疗手段提供理论依据。

囊泡运输是真核生物物质运输的基本细胞过程，而SNARE 对于运输囊泡和靶膜的融合至关重要，因此SNARE的相关研究能够从全局了解囊泡运输系统。在本研究中，我们发现了缺失SM蛋白 TgSec1 导致质膜蛋白错误定位，缺失TgVps45 的条件性敲除导致虫体形态学变化、内膜复合物的丢失、子代虫体的极化以及膜微管的成核的缺陷。TgVps45和TgStx16以及TgStx6相互作用。缺失TgStx16能够导致和TgVps45类似的表型。本研究进一步分析了弓形虫SNARE 的亚细胞定位，并揭示了它们在弓形虫囊泡运输中的作用。我们的结果发现了 SNARE 在内质网 (ER)（TgStx18和 TgStx19）、高尔基体 (TgGS27) 和内体样隔室（TgStx10 和 TgStx12）中的特定定位。最重要的是，我们发现了一种定位于顶质体的 R-SNARE (TgVAMP4-2)。TgSNAP29和TgVAMP4-2形成复合物参与顶质体的靶向运输。.顶复门原虫有独特的细胞器结构，包括顶端复合体，内体样区室、顶质体等。因此，很难借鉴其它模式生物的研究结果理解顶复门原虫内囊泡运输途径。本成果解析了弓形虫分泌途径中的囊泡融合分子机制，发现了许多独特的SNARE蛋白参与弓形虫分泌途径中的囊泡融合过程。另一方面，本成果发现了新型顶质体靶向转运途径。研究成果揭示了自噬系统在弓形虫顶质体生物发生过程中，参与顶质体靶向转运的基本功能。最后，虽然囊泡运输可能是细胞内蛋白转运的主要途径，但是到目前为止，尚没有研究证明任何的囊泡运输途径相关分子（包SNAREs、栓留复合物和Rab GTP酶等）参与复杂质体（包括顶质体）的物质转运。本研究成果丰富了对内共生来源复杂质体生物发生的理解。因为宿主体内不存在这些顶复门原虫的特有的囊泡运输途径，因此，深入挖掘参与此通路的相关基因研究意义在于有助于发现更多具有潜力的药物靶点基因。另外，自噬途径对于弓形虫维持缓殖子阶段至关重要。针对自噬途径开发抗弓形虫慢性感染的药物具有极大的潜力。同时，利用基因缺失技术敲除这些影响弓形虫维持缓殖子阶段的关键基因，有望开发出弓形虫弱毒疫苗。